肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞PLC/PRF/5耐药性的影响及其机制

目的：探讨肝星状细胞条件培养基（hepatic stellate cell conditioned medium,HSC-CM）对人肝癌PLC/PRF/5细胞耐药性的影响及其可能的机制。 方法： 用无血清RPMI 1640培养肝星状细胞LX-2,使其在缺营养的环境下活化,收集其条件培养上清即为HSC-CM。PLC/PRF/5细胞在HSC-CM条件下培养24 h后,顺铂处理12 h或24 h,采用流式细胞术检测PLC/PRF/5细胞的凋亡情况,MTT法检测PLC/PRF/5细胞的增殖,real-time PCR检测PLC/PRF/5细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）相关基因的表达水平。 结果： 顺铂组12和24 h两个时间点PLC/PRF/5细胞的凋亡率为（22.34±1.12）%和（26.78±1.56）%;HSC-CM+顺铂组细胞的凋亡率为（17.22±1.42）%和（21.52±1.76）%,顺铂组细胞凋亡率显著高于HSC-CM+顺铂组（P<0.05）。同在这两个时间点,顺铂组和HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞的增殖活性分别为（68.65±2.56）%和（79.47±1.43）%,（46.54±3.65）%和（62.77±2.89）%,HSC-CM+顺铂组细胞增殖活性均高于顺铂组（P<0.05）。Real-time PCR 结果显示,与顺铂组相比较,HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞中上皮标记物钙黏蛋白（E-cadherin）的表达下降（P<0.05）,而间质细胞标记物神经黏附素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）以及EMT相关转录因 子Snail和ZEB1的表达显著上调（P<0.01）。 结论: HSC-CM可能通过诱导PLC/PRF/5细胞发生EMT,从而增强PLC/PRF/5 细胞对顺铂的抵抗作用。     

RNA干扰BNIP3表达对LoVo细胞5-氟脲嘧啶化疗敏感性的影响

目的：观察RNA干扰介导BNIP3基因表达抑制对结肠癌细胞5-氟脲嘧啶（5-Fu）化疗敏感性的影响。方法：构建靶向BNIP3基因的siRNA的质粒表达载体,转染结肠癌LoVo细胞并筛选稳定表达细胞,用RT-PCR和Western blotting检测BNIP3基因表达,MTT法检测5-Fu的化疗敏感性,流式细胞仪检测5-Fu诱导的细胞凋亡,细胞生长曲线检测细胞增殖。结果：酶切和测序证实靶向BNIP3基因的siRNA的质粒表达载体（pGCsi3．0-BNIP3）构建成功;重组质粒转染的LoVo细胞BNIP3表达被有效抑制,其mRNA水平和蛋白水平表达抑制率分别为73．1％和75．4％;与对照组比较,转染重组质粒pGCsi3．0-BNIP3的LoVo细胞5-Fu的Ic50值显著升高（108．4&#177;4．69μg／mlvs．50．08&#177;2．85μg／ml,P〈0．05）,5-Fu诱导的细胞凋亡率显著减少（8．35&#177;0．46％v19．75&#177;2．37％,P〈0．05）,细胞增殖速度增加。结论：BNIP3表达下调导致结肠癌LoVo细胞对5-Fu化疗敏感性降低;BNIP3可能成为逆转结肠癌耐药的潜在治疗靶点。     

不同重组病毒载体在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染效率及基因表达

目的：探讨不同的重组病毒载体对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的转染效率和外源基因表达水平,为利用骨髓间充质干细胞进行细胞和基因治疗提供实验依据。方法：采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心及体外培养方法分离rMSCs,流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD45和CD90的表达鉴定细胞类型。进一步用携带绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组Ad5-EGFP、Ad5F35-EGFP、rAAV1/2-EGFP、rAAV2-EGFP及Lentivirus-EGFP转染体外培养的rMSCs,荧光显微镜观察、流式细胞仪检测EGFP阳性率和荧光强度。结果：rMSCs细胞表面CD11b、CD45和CD90阳性率分别为（14.1±3.3）%、（1.1±0.4）%和（82.3±5.7）%。Ad5-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后流式细胞仪检测,EGFP阳性率分别为（33.6±2.7）%、（88.6±1.0）%及（99.9±0.1）%,荧光强度为4.4±0.3、39.8±1.5及811.4±3.9;Ad5F35-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后阳性率分别为（96.9±0.4）%、（99.9±0.1）%及（99.7±0.1）%,荧光平均强度为369.3±14.8、895.4±7.5及703.2±38.4;rAAV1/2-EGFP及rAAV2-EGFP按1×104和1×105vg/细胞转染rMSCs,6d后阳性率分别为（0.94±0.31）%及（1.30±0.36）%,和（2.16±0.38）%及（3.90±0.33）%;LV-EGFP按30（TU/细胞）转染rMSCs,6d后阳性率为（60.5±3.2）%,荧光强度为27.0±3.6。结论：Ad5、Ad5F35及LV能够有效转染体外培养的rMSCs并表达外源基因,转染效率与病毒的用量间存在量效关系。     

二烯丙基二硫诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡及其可能的分子机制

背景与目的：二烯丙基二硫（DADS）是大蒜中的一种脂溶性单体化合物,对多种肿瘤细胞有促凋亡作用.本实验旨在探讨DADS抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖与诱导凋亡的生物学效应及可能的分子机制.方法：分别采用MTT、光学显微镜、流式细胞仪、DNA琼脂糖凝胶电泳与Western blot检测DADS抑制CNE2细胞增殖与诱导凋亡作用及Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase 3）蛋白的表达.结果：MTT结果显示,50、100、200及400 μmol/L DADS作用CNE2细胞48 h,抑制率分别为3.66%、14.25%、29.66%及61.28%,呈浓度依赖性（P＜0.05）.形态学观察发现,DADS处理24 h后,部分CNE2细胞变圆,体积明显缩小,胞质强嗜酸性,核固缩、深染,核染色质积聚至核膜周边,呈现凋亡细胞形态学改变.流式细胞术分析显示,50、100、200和400 μmol/L DADS作用24 h,凋亡率分别为（10.8±1.3）%、（14.8±1.1）%、（21.7±2.0）%及（29.8±2.6）%,呈浓度依赖性诱导CNE2细胞凋亡（n=3,P＜0.05）.200及400 μmol/L DADS分别作用CNE2细胞24 h后,DNA凝胶电泳出现典型梯形条带.Western blot检测显示,50、100、200和400 μmol/L DADS处理CNE2细胞24 h后,Bcl-2蛋白与β-Actin的灰度值比分别是1.92±0.21、1.21±0.18、0.89±0.14及0.41±0.09,与对照组（2.24±0.26）比较,差异有显著性（P＜0.05）;Bax蛋白与β-Actin的灰度值比分别是0.78±0.14、1.12±0.19、1.54±0.22及2.08±0.27,与对照组（0.33±0.08）比较,差异有显著性（P＜0.05）;随浓度的增加,Bcl-2蛋白下调,Bax蛋白表达上调.200、400 μmol/L DADS处理CNE2细胞24 h后,与对照组相比,Caspase 3酶原蛋白条带变细并且可见到蛋白裂解产物,表明DADS可以促进Caspase 3的活化.结论：DADS具有抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能与Bcl-2蛋白下调,Bax蛋白表达上调导致Bcl-2/Bax比值下降,促进Caspase 3的活化有关.     

NS-398和罗格列酮协同诱导胰腺癌细胞凋亡的研究

目的探讨特异性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398和过氧化物酶体增殖因子活化受体（PPAR）γ激动剂罗格列酮对人胰腺腺癌细胞株SW1990细胞凋亡的调控作用及其机制。方法SW1990细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM液中,常规培养24 h后加NS-398（150μmol/L）和（或）罗格列酮（50μmol/L）,连续培养48 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,逆转录-聚合酶链反应（RT- PCR）法检测凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA表达。结果NS-398组、罗格列酮组和联合用药组的细胞凋亡率分别为（10.65±3.93）%、（14.51±2.36）%和（25.87±5.24）%,显著高于对照组的（3.12±1.76）% （P〈0.05和P〈0.01）,联合用药组的细胞凋亡率明显高于NS-398或罗格列酮单一用药组（P〈0.01）。NS-398和罗格列酮显著下调Bcl-2 mRNA在SW1990细胞的表达（P〈0.01）。结论NS-398、罗格列酮通过下调Bcl-2基因表达而诱导细胞凋亡,两者联合使用具有协同作用。     

双歧杆菌对小鼠黑素瘤B16细胞增殖和细胞周期的影响

目的：探讨双歧杆菌对小鼠恶性黑素瘤B16细胞的增殖及细胞周期的影响。方法：用MTT比色法测定B16细胞活力,用H-E染色法观察B16细胞形态,用流式细胞术测定B16细胞周期。结果：1×10^9cfu/ml的双歧杆菌作用B16细胞24h后,细胞增殖抑制率为36.69%;1×10^8cfu/ml的双歧杆菌作用B16细胞72h后,抑制率为63.47%;由此可见,双歧杆菌对B16细胞具有显著的增殖抑制作用。经双歧杆菌处理后,B16细胞核浆比例下降,细胞变小,核仁减少,说明B16细胞胞质和细胞核都趋于成熟化;经双歧杆菌处理后B16细胞周期阻滞于G1期[对照组和处理组G1期细胞比例分别为（41.22±1.15）%和（67.25±3.13）%],但凋亡作用不明显[处理组凋亡率为（1.87±0.04）%]。结论：双歧杆菌通过影响细胞周期抑制B16细胞的生长。     

腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应

目的：探讨复制缺陷型腺病毒载体（Ad）介导人血管内皮细胞生长因子受体-2（hVEGFR-2或hKDR）胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果。方法：构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7d后取脾细胞作为效应细胞（E）,Hepa1-6/mKDR作为靶细胞（T）,行乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa1-6,观察荷瘤小鼠成活情况。结果：Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E∶T为100∶1、50∶1和25∶1时,Ad hKDRE诱导的6hCTL杀伤率分别为（81.5±5.6）%、（68.4±5.5）%和（39.6±3.9）%。Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×10^6 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%。上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8＋和CD4＋ T淋巴细胞后消失。结论：Ad介导异种（人）KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4^＋和CD8^＋ T细胞依赖性的。     

紫杉醇-奥曲肽耦连药靶向治疗非小细胞肺癌

目的：在合成紫杉醇-奥曲肽（paclitaxel-octreotide,PTX-OCT）耦连药物的基础上,评价耦连药物对人非小细胞肺癌细胞A549和Calu-6的细胞毒性和靶向性。方法：合成并纯化紫杉醇-奥曲肽耦连药物PTX-OCT和2PTX-OCT。RT-PCR法检测人非小细胞肺癌A549和Calu-6细胞及人成纤维细胞中生长抑素受体（somatostatin receptor,SSTR）的表达;设置3种药物浓度为1、100nmol/L和1μmol/L与癌细胞共同培养,培养时间为24~72h,同时设置对照组;MTT法检测药物对A549、Calu-6细胞以及人成纤维细胞的毒性;流式细胞术检测1μmol/L紫杉醇、PTX-OCT和2PTX-OCT作用后A549细胞周期变化。结果：人非小细胞肺癌A549和Calu-6细胞均表达SSTR2和SSTR5 mRNA,在人成纤维细胞中未检测到SSTR亚型mRNA。紫杉醇-奥曲肽耦连药物对A549和Calu-6细胞的杀伤作用与紫杉醇类似,具有浓度依赖性和时间依赖性;1μmol/L紫杉醇及PTX-OCT和2PTX-OCT作用72h,A549细胞生存率分别为（26.9±7.3）%、（26.6±9.2）%和（35.7±4.3）%;Calu-6细胞生存率分别为（29.5±5.0）%、（28.2±9.7）%和（26.5±4.9）%;均低于24h组（P〈0.05）。1μmol/L紫杉醇作用24h后成纤维细胞生存率为（64.7±8.6）%,PTX-OCT和2PTX-OCT组分别为（86.1±1.8）%和（90±5.6）%,均高于紫杉醇组（P〈0.05）。流式细胞术分析PTX-OCT和2PTX-OCT及紫杉醇作用后,A549细胞周期均停滞在G2/M期。结论：紫杉醇-奥曲肽耦连药物具有细胞毒性和靶向性,紫杉醇-奥曲肽耦连药物有希望作为一种新的靶向药物来治疗非小细胞肺癌。     

氟比洛芬酯联合颈丛神经阻滞用于甲状腺癌联合根治术的超前镇痛

背景与目的：超前镇痛是伤害性刺激作用于机体之前采取的一种措施,可防止神经中枢敏感化,减少和消除伤害引起的疼痛。本研究采用氟比洛芬酯联合颈丛神经阻滞用于甲状腺癌联合根治术的超前镇痛,采用多药物多途径的多模式联合超前镇痛,以尽可能消除外周和中枢敏化的形成,从而取得完善、长效的镇痛效果。方法：2009年6-8月间,选择60例择期行单侧甲状腺癌联合根治术的患者,随机分成A、B和C3组,A组：氟比洛芬酯＋颈丛神经阻滞作为的联合超前镇痛;B组：颈丛神经阻滞作为超前镇痛;C组：单纯全麻组。A组术前30min及皮肤缝合毕即刻分别给氟比洛芬酯50mg稀释至20mL静脉缓慢（1min以上）推注,B、C组分别在相同时点给予生理盐水对照,A、B组均行双侧浅颈丛神经阻滞,给予0.375%罗派卡因20mL。记录A、B两组颈丛阻滞起效时间、手术时间、拔管时间以及芬太尼用量。分别于术后1、4、8、24h疼痛视觉模拟评分（visual analogue scale,VAS）（静息和活动）,以及恶心呕吐、嗜睡、呼吸抑制等不良反应的发生情况。结果：在神经阻滞的起效时间上A、B组分别是（7.47&#177;1.04）和（8.75&#177;136）min,两组相比差异有统计学意义（P〈0.05）;术中A、B和C组芬太尼用量分别是（0.36&#177;0.04）、（0.40&#177;0.06）和（0.45&#177;0.07）mg,A组与B组、A组与C组相比,差异均有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）;术后疼痛视觉模拟评分方面,术后4h和8h（活动）A、B组与C组分别是（26&#177;8）和（32&#177;6）、（25&#177;6）和（37&#177;5）、（36&#177;6）和（40&#177;6）mm,A组与C组、B组与C组、A组与B组相比,差异均有统计学意义（P均〈0.05）;而术后24h（静息和活动）A、B和C组分别是（25&#177;4）和（34&#177;5）、（27&#177;5）和（36&#177;5）、（31&#177;5）和（40&#177;6）mm,A组与C组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。不良反应方面,恶心呕吐发生情况A、B与C组分别是1、0和5例。结论：氟比洛芬酯联合颈丛神经阻滞用于甲状腺癌联合根治术的超前镇痛可以提供更加快速、完善、长效的镇痛效果,起到阿片类药物节约效应,可有效地减少其不良反应的发生。     

siRNA干扰Chk1抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究

背景与目的：细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase1,Chk1）与肿瘤的关系及其在肿瘤发生、发展及治疗中的作用是目前研究的热点。为探索Chk1在人类肿瘤细胞中对生长增殖活性和细胞周期的调控作用,本研究旨在观察siRNA干扰Chk1基因对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。方法：采用RNAi技术抑制BGC823细胞中Chk1表达,采用Western blot检测转染前后Chk1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和Chk1siRNA转染组三组。然后采用MTT法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。结果：Western blot检测结果显示,Chk1siRNA转染24h后,BGC823细胞中Chk1蛋白相对灰度值为0.11&#177;0.08,明显弱于未转染对照组的0.66&#177;0.21和脂质体转染组的0.70&#177;0.25（P〈0.05）,而未转染对照组和脂质体转染组之间比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。转染Chk1siRNA的BGC823细胞其Chk1蛋白表达量下降了83.1%。MTT法检测结果显示,Chk1蛋白表达缺失可导致BGC823细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为48.1%（P〈0.05）。FCM法检测结果显示,Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,未转染组24和48h后细胞在G0/G1期为48.3%和50.2%,转染Chk1siRNA组细胞在转染24和48h后G0/G1期增加至63.9%和66.1%,增殖指数（PI）由51.7%（24h）和49.8%（48h）减少至36.2%（24h）和34.4%（48h）。结论：Chk1siRNA转染可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关。     

Mutations and Deregulation of Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR Cascades Which Alter Therapy Response

The Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascades are often activated by genetic alterations in upstream signaling molecules such as receptor tyrosine kinases (RTK). Certain components of these pathways, RAS, NF1, BRAF, MEK1, DUSP5, PP2A, PIK3CA, PIK3R1, PIK3R4, PIK3R5, IRS4, AKT, NFKB1, MTOR, PTEN, TSC1, and TSC2 may also be activated/inactivated by mutations or epigenetic silencing. Upstream mutations in one signaling pathway or even in downstream components of the same pathway can alter the sensitivity of the cells to certain small molecule inhibitors. These pathways have profound effects on proliferative, apoptotic and differentiation pathways. Dysregulation of components of these cascades can contribute to: resistance to other pathway inhibitors, chemotherapeutic drug resistance, premature aging as well as other diseases. This review will first describe these pathways and discuss how genetic mutations and epigenetic alterations can result in resistance to various inhibitors.     

多孔PAN/CS/BCP/PLGA复合支架的制备与分析表征

目的探讨多孔聚丙烯晴基碳纤维/壳聚糖/双相磷酸钙/聚乳酸-羟基乙酸(PAN/CS/BCP/PLGA)复合支架作为骨组织工程支架材料的可行性。方法采用湿法合成双相磷酸钙,真空冷冻干燥技术制备多孔PAN/CS/BCP/PLGA复合支架,测定抗压强度、阿基米德法测定孔隙率及体外模拟生物活性,并采用XRD、SEM分析相结构及形貌特征。结果 PAN/CS/BCP/PLGA复合支架中添加4wt%PAN后,平均孔隙率大于85%,抗压强度大于5.9 MPa,提高了6倍,生物可降解速率低于9.5%,呈现多孔贯通形貌,孔径平均为400～500μm,PAN分布均匀,体外模拟实验表明支架表面生成类骨磷灰石。结论多孔PAN/CS/BCP/PLGA复合支架具备良好的生物活性和生物可降解性,为其成为骨组织工程支架材料提供理论依据。     

Detoxifying potential of thioproline against N-nitroso compounds, N-nitrosodimethylamine and N-nitrosocimetidine

Thioproline (TPRO), an effective nitrite trapping agent in vivo, was examined for its detoxifying ability in rats against N-nitrosodimethylamine (NDMA) and N-nitrosocimetidine (NCIM). When NDMA (37–101.5 mg/kg) was administered with TPRO (532 mg/kg), no influence of TPRO on NDMA-induced lethality and histological results in liver were observed. NDMA oxygenase activity measured by formaldehyde formation was not affected either. Denitrosation is a route of detoxication of N-nitroso compounds. When NCIM (100 mg/kg), a direct acting mutagen but not carcinogen, was given by gavage with TPRO, urinary excretion of N-nitrosothioproline (NTPRO) in rats apparently increased compared with TPRO alone. This result shows that TPRO is a trapping agent in vivo for nitrosating (NO) species originating from N-nitroso compounds, e.g., NCIM, which are denitrosated non-enzymatically in stomach acidic conditions. Transnitrosation from NDMA to TPRO, where enzymatic denitrosation is required, did not occur in measurable amount after oral administration of NDMA and TPRO.