融合表达Fas死亡信号激发域的重组载体FasAD-pTYB2的构建

目的构建融合表达Fas死亡信号激发域(Fasactivationdomain,FasAD)的重组载体FasAD-pTYB2。方法应用半巢式逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术克隆Fas死亡信号激发域cDNA片段FasAD,插入通用载体pGEM-T中鉴定,然后装入Intein表达型原核载体pTYB2中,经IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达融合蛋白。结果DNA序列测定显示克隆的cDNA片段序列正确。初步获得融合蛋白的表达,经Western-blotting鉴定,融合蛋白具有良好的Fas抗原性。结论上述结果提示可利用该表达型重组质粒制备人Fas死亡信号激发域多肽/intein的融合蛋白。     

人IL-16在大肠杆菌中的融和表达

目的 将人IL－16 cDNA克隆至原核融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3上，并进行表达研究。方法 含IL－16 cDNA的质粒IL－16／PGEM－3ZF（＋）和Pinpoint^TM Xa－3原核融合表达载体经酶切消化、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作，获得重组质粒Pinpoint^TM－IL－16，将质粒Pinpoint^TMXa-IL-16转化至大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达JM109工程菌，Western blotting检测表达产物。结果 IL－16 cDNA成功克隆至融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3,Western blotting检测经诱导含有Pinpoint^TM Xa－IL－16质粒的JM109细菌，有IL－16融合蛋白的表达。结论 成功地表达了IL－16融合蛋白。     

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）编码基因，表达TRP－2蛋白。方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP－2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融全表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP－2／GST融合蛋白。结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP－2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2,表达了TRP－2／GST融合蛋白。结论 成功克隆了人TRP－2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP－2／GST融合蛋白。     

含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

目的：构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3（ζ）和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果：经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论：应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

目的通过从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆编码人IL-16的cDNA基因,构建人IL-16的原核高效表达系统。方法从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA,利用半巢式RT-PCR、T-A克隆等技术得到特异的cDNA片段;将含有IL-16 cDNA的质粒IL-16-PUC18和原核表达载体PMAL-C2经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作,获得重组质粒PMAI-C2-IL-16,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌,Westem blotting检测表达产物。结果经序列测定证实,所得片段为IL-16cDNA;Western blotting检测重组体中确有抗IL-16抗体的融合蛋白表达。结论成功克隆了中国人IL-16 cDNA,并表达了IL-16融合蛋白。     

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因，研究其基因工程疫苗，方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出EBV B95．8株LMP2A全部编码蛋白的基因，并克隆至载体pGEM-T中，通过α－插入失活，PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒，采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸 序列。结果：克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA，测序结果与EB病毒B95．8原型株LMP2AcDNA作同源比较，完全一致，结论：本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。     

人HSC70基因真核表达载体的构建和表达

目的构建HSC70（HSC）真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法采用RT—RCR方法从正常人肝细胞系QZE中得到HSC70的cDNA序列，然后克隆入pcDNA^TM3．1／V5-His^A载体，构建重组质粒pcDNA-HSC70；经酶切和测序鉴定后，将pcDNA-HSC70体外转染HepG2细胞系，瞬时表达带有His标签的HSC70融合蛋白；并通过免疫细胞化学方法检测蛋白表达情况。结果RT—PCR扩增到1960bp的HSC70 cDNA片断，经测序分析与GenBank中已知序列一致；重组质粒pcDNA—HSC70转染后的HepG2细胞中，可检测到瞬时表达的HSC70-His融合蛋白。结论成功构建重组质粒pcDNA—HSC70，并可以在真核细胞HepG2中瞬时表达。     

人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建

目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hALR ;将hALRcDNA亚克隆于 pGEX - 4T质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果 :重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点 ,片段与PCR扩增片段大小相同 ,碱基序列正确。结论 :GST -hALR融合蛋白表达载体的成功构建 ,为获得较大量基因工程hALR产品用于重症肝炎治疗打下基础     

人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1)cDNA,构建原核表达质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并诱导表达谷胱甘肽疏基转移酶-hGLP-1(GST-hGLP-1)融合蛋白。方法：采用亚磷酸二酯法合成6个hGLP-1cDNA的寡核苷酸片段,拼接成完整的hGLP-1cDNA,克隆至pBSSK( /-)载体中,经双酶切鉴定和测序后把hGLP-1cDNA定向插入融合基因表达体pGEX-4T-3的多克隆位点上,构建重组质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并转化大肠杆菌TG1。结果：经限制性内切酶合蛋白GST-hGLP-1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hGLP-1创造条件。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

人脂联素球型结构域原核表达重组质粒的构建及体外表达

目的 通过分子克隆表达人脂联素基因球型结构域(gAd),为进一步研究提供实验基础.方法 应用RT-PCR方法从人大网膜脂肪组织总RNA中扩增出gAd cDNA,克隆人载体pMD18-T,pET32a( )中,形成重组质粒gAd.pET32a( ).筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切、PCR和测序进行鉴定,并在体外进行小量表达.结果 从脂肪组织总RNA中扩增得到412 bp片段gAd基因,其cDNA序列与GenBank人gAd基因序列相同,并在体外表达得到相对分子质量为34000的重组蛋白.结论 成功构建了gAd基因原核表达质粒并实现体外的小量表达.     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

GCF2基因片段原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建肝癌相关抗原GCF2基因片断(323～1 234 bp)原核表达重组质粒.方法 提取人肝癌组织总RNA,通过反转录酶合成cDNA;根据GenBank公布的GCF2基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出人GCF2基因片断(编号2-5a),将此片段连接在克隆载体pGEM-T上进行测序,通过酶切、连接将...     

十二指肠钩虫ASP-2基因密码子优化及在大肠杆菌中高效表达

目的:获得十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)分泌蛋白2(mAd-ASP-2)编码基因,构建其高效表达的大肠杆菌表达体系?方法:以RT-PCR的方法得到克隆了编码mAd-ASP-2的成熟肽全基因序列,克隆入原核表达载体pET-22b(+)中,组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2?利用大肠杆菌偏爱密码子和GenScript rare codon analysis 软件获得优化密码子优化的mAd-ASP-2*基因序列并人工合成该基因,将其克隆入原核表达载体pET-22b(+),组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2*?将这2个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami-2(DE3)中,经IPTG诱导表达?结果:同样条件下,密码子优化的mAd-ASP-2*基因比优化前能够获得较高的表达,且以可溶形式存在?利用His Trap HP亲和柱获得了纯化的重组蛋白mAd-ASP-2*,确定了纯化重组蛋白咪唑洗脱液最佳浓度为200 mmol/L?Western blot分析结果进一步显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白?结论:通过密码子优化实现了十二指肠钩虫ASP-2的高效表达,为进一步研究Ad-ASP-2的功能和以其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础?