GSH减少可加强MNNG对P38 MAPK磷酸化

目的：了解低浓度N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）对P38MAPK的影响, 以及谷胱甘肽（GSH）在该信号通路中的调节作用。 方法： 用L-丁硫氨酸-S,R-磺基(L-buthionine-S,R-sulfoximine) 减少细胞谷胱甘肽含量后，采用Western印迹法比较MNNG处理组和对照组P38MAPK磷酸化状态, 观察MNNG对P38磷酸化状态的影响。用光密度扫描仪测定各蛋白质条带吸光值。“P”为磷酸化P38MAPK的吸收值，“T”为总P38MAPK吸收值。在各时点以对照组磷酸化率P/T为1.0,计算MNNG组的相对磷酸化率。结果： BSO预处理24 h后，MNNG处理2.5 h的相对磷酸化率为0.84，2.5 h处理后换DMEM全培养基3 h的相对磷酸化率2.19。 结论： 细胞内GSH含量降低可促进P38MAPK的活性。     

MNNG诱导TERC基因沉默的16HBE细胞恶性转化模型的建立

目的: 建立N-甲基em>N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)诱导的人端粒酶RNA组分(telomerase RNA component, TERC)缺陷的人支气管上皮细胞株(16HBE)恶性转化细胞模型。方法:将靶向TERC基因的shRNA干扰质粒载体转染16HBE细胞,G418抗性克隆筛选得到稳定转染的16HBE-1细胞,RT-PCR检测16HBE-1细胞TERC mRNA的干扰效率;用1 mg/L MNNG对16HBE-1细胞进行隔代染毒,每次染毒1 h;直到染毒27次转化灶的出现。分离扩增转化灶细胞并命名为16HBE-T,用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定细胞的转化程度。结果:从转化灶分离培养的细胞能在软琼脂中生长,且转化细胞能在裸鼠体内成瘤,HE染色后光镜下显示为鳞癌。结论:成功建立MNNG诱导的TERC基因缺陷的16HBE细胞恶性转化模型。     

内质网应激参与低浓度DNA加成性损伤剂诱发的细胞应答反应

目的：研究内质网应激在DNA损伤剂/致癌物诱发的细胞应答反应中的作用。 方法: 选择3种引起不同DNA损伤类型的DNA损伤剂/致癌物，烷化性DNA损伤剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG），大块加成性DNA损伤剂苯并［a］芘-7,8-9-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE，环境致癌物苯并［a］芘在体内代谢形成的终致癌物）以及交联性DNA损伤剂丝裂霉素C（MMC）对人羊膜细胞FL系内质网应激反应的影响。采用SDS－PAGE 和免疫印迹法检测内质网应激蛋白GRP78/BiP, GADD153/CHOP的表达改变和定位于内质网的半胱天冬酶-12(caspase-12)的激活。 结果： 低浓度MNNG（0.25 μmol/L和1 μmol/L）和BPDE（5 nmol/L和50 nmol/L）均能引起FL细胞中GRP78/BiP和GADD153/CHOP的上调和caspase-12的激活；3种浓度的MMC（5 μmol/L、50 μmol/L和500 μmol/L）均引起GRP78/BiP的下调，不伴有GADD153/CHOP水平的改变和caspase-12的激活，更低浓度的MMC（5 nmol/L 和50 nmol/L）对此并无影响。 结论： 低浓度MNNG和BPDE可诱发暴露细胞的内质网应激，而MMC则导致在内质网应激反应诱发过程中起介导作用的GRP78/BiP蛋白的下调，从而可能改变细胞对内质网应激原的反应性。内质网应激在DNA损伤剂/致癌剂诱发的细胞应答反应中有一定作用。     

实时荧光定量PCR的应用体会

对于病毒的监测和疾病的诊断,定性检测已不能满足临床需要,实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative PCR)于1996年由美国Aplied Biosystems公司推出.     

实时荧光定量PCR检测幼儿腹泻腺病毒

目的:建立实时荧光定量PCR方法,并检测腺病毒Ad40或Ad41感染的粪便标本。方法:用T-A克隆技术构建含腺病毒基因的载体作为标准模板,采用Taqman探针标记技术,建立实时荧光定量PCR方法。采集幼儿腹泻标本248例,分别用直接免疫荧光法和实时荧光定量PCR检测腺病毒Ad40和Ad41,比较两种方法的阳性检出率。结果:实时荧光定量PCR灵敏度和准确度(95.60%和96.80%)均高于直接免疫荧光法(78.5%和82.40%)(P0.05),而两者特异度差异无统计学意义(97.30%vs 96.70%,P0.05)。248例待检样本,直接免疫荧光法检出率为2.42%(6/248),实时荧光定量PCR检出率为7.66%(19/248),明显高于直接免疫荧光法(χ2=3.675,P0.05)。结论:成功建立实时荧光定量PCR检测腺病毒Ad40或Ad41方法。其灵敏度、准确度和阳性检出率经均优于直接免疫荧光法,且简便快速。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的建立心房钠尿肽（ANP）基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价。方法以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平。结果所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一。肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍。结论所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性。肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高。     

实时荧光定量PCR法筛查唐氏综合征的实验研究

目的建立一种无创性、高特异性的快速筛查唐氏综合征（Down’s syndrome,DS）的检测方法。方法采用实时荧光定量PCR技术对正常人和DS患者外周血样本的有核细胞进行检测,根据△Ct值的差异建立检测方法。结果正常组和唐氏组△Ct值有显著性差异（P〈0．001）,初步建立了实时荧光定量PCR筛查唐氏综合征的快速检测方法。结论实时荧光定量PCR具有无创性、特异性高且简单、快速等优点,适用于唐氏综合征产前筛查。     

实时荧光定量PCR在细胞因子mRNA检测研究中的应用

RR-FQ-PCR技术是一种最新PCR技术,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点.本文就RT-FQ-PCR概念、原理、方法、研究进展及其在细胞因子mRNA检测中的应用等作一综述.     

实时荧光定量PCR检测腮腺沃辛瘤中Gadd45β表达

目的：从分子学水平检测腮腺沃辛瘤相对于瘤旁腮腺组织中生长抑制和DNA损伤修复基因45β（ Gadd45β） mRNA表达情况并探讨其在沃辛瘤的形成及发展中的意义。方法搜集30例腮腺沃辛瘤组织及瘤旁正常腮腺组织。提取总RNA,然后进行逆转录得到cDNA,再进行实时荧光定量PCR检测,测出CT值,通过2－△△CT的相对定量的方法对荧光定量PCR检测的CT值进行标准化,从而比较肿瘤组织及瘤旁正常腮腺组织中Gadd45βmRNA表达情况。结果 Gadd45β在正常腮腺组织及肿瘤组织中均有表达,分别为1．516±0．104和1．177±0．089, Gadd45β在沃辛瘤中表达明显下调（P＜0．05）。结论 Gadd45β表达下调可作为沃辛瘤发病机理一部分。     

实时荧光定量PCR在检测孕妇血HCMV感染中的研究

目的探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测孕妇血中巨细胞病毒(HCMV)感染的应用。方法采用FQ-PCR技术,对临床疑为HCMV病毒感染的326名孕妇(观察组)和健康孕妇(对照组)210名进行检测。结果观察组和对照组的检出率分别为42.33%、3.81%,观察组HCMV感染率明显高于对照组(χ2=95.6305,P<0.01),两者之间有显著差异。结论FQ-PCR检测HCMV具有方法简单、快速、特异性强、定量准确等优点,应推荐作为检测孕妇血中HCMV感染的首选方法。     

Proteomic analysis of cellular responses to low concentration N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in human amnion FL cells

We have shown previously that exposure to a low concentration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) induces comprehensive changes in the protein expression profile of human amnion FL cells, including the induction, suppression, upregulation, and downregulation of various proteins. In addition, by proteomic analysis combining two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry, some of the induced and suppressed proteins were identified. In this study, we identified an additional 18 proteins among those that were either up- or downregulated by MNNG treatment. The proteins identified were a heterogeneous group that included several zinc finger proteins, proteins involved in signal transduction, cytoskeletal proteins, cell-cycle regulation proteins, and proteins with unknown functions. The involvement of these proteins in the cellular responses to alkylating agents has not been reported before and their physiological relevance is not clear. Therefore, our findings may help better understand the global cellular stress responses to chemical carcinogens, and may lead to new studies on the functions of these MNNG-responsive proteins. Furthermore, some of these proteins may serve as biomarkers for detecting exposure of human populations to environmental carcinogens.     

人类细胞系基因表达中校正因子的选择

目的以人类6种细胞系为研究对象,确定基因表达研究中最佳的校正因子。方法收集用苯并芘、过氧化氢、紫外线对应处理的H1299、U251、HUVEC,同时以无任何处理的这3种细胞为对照组,上述细胞的融合率均为70％;并收集无任何处理、融合率分别为100％、70％的293T、HepG2、HeLa细胞。细胞计数后,向每种细胞系中加入其1／10数目的大鼠肝细胞,混合均匀后抽提总RNA、反转录合成cDNA第一链、绝对定量PCR。借助大鼠肝细胞中Polr2a的表达量校正固有实验误差,分析比较不同分组间各校正因子间的表达稳定性。结果定量数据经校正、分组分析后,得出变异系数最小的3种校正因子,分别为18srRNA、总RNA、POLR2A。结论POLR2A更适合被选作基因表达研究中的校正因子。     

H5亚型禽流感灭活疫苗病毒基因的定量检测及其与HI抗体效价之间关系的分析

目的建立H5亚型禽流感病毒灭活疫苗中病毒核酸的特异、敏感、快速的定量检测方法，分析其与HI抗体效价之间的相关性。探索禽流感灭活疫苗效力体外检验的方法。方法选取H5亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守序列，使用Prinler Express 2．0软件设计了特异性引物和TaqMan MGB（minor groove binder）探针，利用实时荧光PCR技术来定量检测禽流感灭活疫苗，通过体外转录，制备含有选定检测序列的RNA标准品，绘制标准曲线。对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测，测定了疫苗的HA基因拷贝数，同时测定了50批疫苗相应的HI抗体效价。进行了疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价之间相关性的分析。结果该方法的灵敏度为10拷贝，反应，标准曲线的相关系数为0．998003，对H9亚型禽流感灭活疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好、重复性佳。疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价不相关。结论荧光定量PCR方法为H5亚型禽流感病毒灭活疫苗检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。     

实时荧光定量PCR法检测人乳头状瘤病毒的实验研究

目的 通过研究病变宫颈中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18型的表达,探讨HPV16/18型病毒感染与宫颈病变发生发展之间的关系.方法 结合病理切片诊断,以免疫组化作对照.运用实时荧光定量PCR技术检测病变宫颈中HPV16/18型DNA拷贝数,以及HPV16/18型E7基因mRNA表达量.结果 慢性宫颈炎患者中HPV16/18型感染率低(7.4%).宫颈管上皮内瘤样变(CIN)组HPV16型感染率较高为69.6%,宫颈癌患者巾为72.7%.HPV16型DNA的拷贝数在宫颈上皮内瘤样变患者中与病理分级没有明显的相关性.但在宫颈癌患者中,病毒DNA的拷贝数明显升高,二者差异明显.CIN轻度(I)、中度(Ⅱ)、高度(Ⅲ)组和宫颈癌患者中,HPV16 E7基冈的表达率分别为0、37.5%、42.9%、63.6%.统计学分析表明,HPV16 E7 mRNA的拷贝数与病情呈明显的正相关性.结论 感染者中主要以HPV16型为主,HPV18型较少.宫颈癌患者中HPV16 DNA拷贝数明显高于CIN Ⅱ、Ⅲ组,HPV16型E7 mRNA在宫颈癌中表达率及表达量明显增加并与宫颈癌变呈正相关.实时荧光定量PCR适合临床宫颈病变病毒的筛查与检测.     

Use of real-time PCR to measure Epstein-Barr virus genomes in whole blood

The measurement of the Epstein–Barr viral load in peripheral blood has been recognised as an important way of monitoring the response to treatment in patients with Epstein–Barr virus (EBV)-related malignancies. In particular, EBV load in transplant recipients can be used as a predictive parameter for Post-transplant Lymphoproliferative Disorder (PTLD). The aim was to develop a rapid and reliable PCR protocol for the quantification of the cell-associated EBV genome. Real-time PCR using TaqMan methodology was established. This technique was applied to determine the EBV load in various study groups including healthy controls, transplant recipients, patients on haemodialysis, and patients with infectious mononucleosis. The baseline level of EBV genomes in the immunosuppressed renal transplant recipients was significantly different from that in the healthy controls.     

MNNG诱导的DNA损伤对人肺癌H1299细胞中FOXO1亚细胞定位的影响

目的探讨甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对DNA造成损伤后,对人叉头蛋白转录因子(FOXO1)核质分布的影响。方法体外培养人肺腺癌细胞系H1299,经不同浓度MNNG处理细胞后,采用彗星电泳、细胞免疫荧光、Western blot等方法,对细胞DNA损伤程度、FOXO1核质定位情况及GADD45蛋白表达变化进行检测。结果 H1299细胞DNA损伤程度随MNNG处理浓度增加而显著增强,伴随DNA损伤程度的加深,FOXO1转录因子在核内的分布逐渐增加,且在细胞DNA发生损伤4h后GADD45表达升高。结论 MNNG能造成H1299细胞DNA损伤,并促进FOXO1转录因子的核转位,从而启动损伤修复过程。     

实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究

目的 建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具.方法 在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性.结果 当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmol/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA 6.0μl,反应条件为预变95℃20 S,变性95℃10 s,退火50℃ 40 s,40个循环时,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝/μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23～16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5 h.结论 TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测.     

实时荧光定量PCR方法检测非霍奇金淋巴瘤患者B淋巴细胞刺激因子表达水平

目的:建立实时荧光定量PCR方法(RFQ-PCR)检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者B淋巴细胞刺激因子(BAFF)表达水平。方法:47例NHL患者及20例健康对照,采用实时荧光定量PCR方法检测其外周血单个核细胞中的B淋巴细胞刺激因子表达水平。结果:RFQ-PCR检测BAFF含量的示灵敏度为10 pg/ml,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为8.56%和11.32%,高浓度样本批内和批间CV分别为0.76%和4.58%。NHL患者和健康对照者BAFF mRNA表达量分别为(0.48±0.023,0.25±0.023),两者具有显著性差异(P=0.0001)。结论:RFQ-PCR检测BAFF mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性。NHL患者BAFF mRNA高表达,提示BAFF可能在NHL发生发展中发挥重要作用。     

B7-H4实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在人胃癌组织中的初步应用

目的建立实时荧光定量PCR检测B7-H4的方法并初步应用于人胃癌组织。方法将B7-H4和内参GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确后克隆入载体pMD19-T,构建重组质粒标准品,并纯化、定量及梯度稀释,分别建立B7-H4和GAPDH的标准曲线,应用实时荧光定量PCR检测8例人胃癌组织中的B7-H4相对于GAPDH的表达情况。结果 B7-H4的最低检测拷贝数为5.27拷贝,线性范围5.27×101~5.27×107拷贝,标准曲线方程y=–3.1395x+41.805,直线回归相关系数r=0.994904,批间变异系数范围2.39%~3.59%,扩增效率108.2%;GAPDH的最低检测拷贝数为38.6拷贝,线性范围3.86×102~3.86×107拷贝,标准曲线方程y=–3.2436x+41.083,直线回归相关系数r=0.998913,批间变异系数范围2.26%~3.86%,扩增效率103.4%。8例人胃癌组织的B7-H4相对于GAPDHmRNA表达水平在0.044~0.888之间。结论荧光定量PCR检测B7-H4的方法具备较高的敏感性和特异性,且系统有良好的重复性和线性范围。