聚合酶链反应中污染环节的分析

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,该技术通过重复94℃～95℃变性、37℃～55℃复性、72℃延伸等简单的3个温度,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性,操作者稍不注意就会造成污染,极微量的污染便可导致假阳性结果,现分别对污染和如何判断污染及污染源的追踪等3个部分进行阐述。1污染为了使读者重视操作堆积化及其重要性,我们将PCR整体绘制成PCR污染示意图,并分别叙述各区的相互关系,图中分为4个区,即污染1区、清洁区、污染2区、交叉污染区等。见图1。     

预防PCR检测中的污染初探

作为一种新的检测技术，PCR具有其它传统方法无与伦比的优点：灵敏度高、特异性强、操作简便等。也存在着严重的不足，极微量的污染即可导致假阳性结果。因此，PCR污染问题已引起人们极大的关注，如何防止PCR污染已成为整个实验成功的关键，现就我院PCR实验室二年来采取的预防污染办法介绍如下：PCR检测过程中的污染来源有三：一是标本间的交叉污染；二是实验室中克隆质粒的污染；三是扩增产物的污染，其中以第三种为最主要，因此冠以“残留污染”（Carryover）。PCR污染可能来自标本处理过程中所伴随的阳性质粒，通过空气和气溶胶…     

医院实验室生物安全柜的消毒

目的观察实验室生物安全柜基因污染情况,采取消毒措施及其消毒效果。方法采用棉拭涂抹采样方法对生物安全柜消毒效果进行评价。结果在消毒前生物安全柜内台面、侧壁和柜内空气采集的样本中经HBV-DNA荧光定量PCR检测显示均有阳性出现。经对柜体内外喷洒75%医用酒精,紫外灯照射消毒30 m in等消毒处理后立即采样检测未出现阳性结果;工作结束后采样,也检测出阳性结果。结论医院实验室生物安全柜内进行乙型肝炎病人标本PCR试验后会造成污染,经过喷洒酒精消毒液和紫外线照射可以有效消除污染。     

实时荧光PCR实验过程污染的监测与防范

正实时荧光PCR 技术是一种实时监测PCR扩增产物,通过CT值和标准曲线的关系对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。其优点是扩增量大、特异性强、灵敏度高、精确定量,但易污染,一直是困扰各实验室的大问题,极微量的污染就可能造成假阳性反应,导致实验结果失败。为了保证实验过程稳定、结果可靠,验证整个操作流程中是否存在污染的可能,必须进行污染的监测。通过有效地监测,采取正确的应对措施,防止或消除污染。1 对照实验是监测PCR污染的重     

罗氏Lightcycler荧光PCR仪检测结果中文操作系统

罗氏Lightcycler实时荧光定量PCR仪是目前国内临床基因扩增检验实验室首选的检测仪器，也是卫生部临床检验中心推荐的定量检测仪器。随着卫生部临床检验中心对各地临床基因扩增检验实验室认可工作的开展，该PCR仪的应用逐渐广泛，但对各家医院的实验室来说都存在操作软件不能直接生成中文报告的问题。由于其操作软件为英文版，且要求英文版的win2k或NT操作系统，软件默认的结果报告只是数据，不能作为正式检验报告单发给患者。为此，我们利用office2000中的Access和Word应用程序，巧妙地解决了中文报告单的生成问题，而且同时建立了检验结果管理系统数据库，以便于结果的查询和分析，现简述如下。     

应用PCR技术观察过氧乙酸喷洒消毒乙型肝炎病毒污染台面的效果

采用PCR等3种方法检测1％过氧乙酸对HBV污染台面喷洒消毒的效果。结果表明,PCR技术检测的阳性率高于RIA法和DNA探针法,同时1％过氧乙酸对HBV的灭活需作用60分钟。     

Taq DNA聚合酶及镁离子浓度对PCR扩增产率的影响

目前,聚合酶链反应(PCR)扩增技术被广泛运用,它具有特异性强、灵敏度高、诊断快速、结果稳定、操作简便等特点。为了使扩增获得最高产物率,本实验室分别以不同浓度的Mg~(2+)、Taq酶做梯度实验,从中摸索出PCR扩增的最佳浓度。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶,美国GIBCO公司、Promega公司产品、本实验室研制生产Taq DNA聚合酶。dNTP、DNA marker为promega产品。PCR扩增Buffer、无菌水为本实验室配制。PCR扩增仪,美国PE公司TC-Ⅰ型。AlphaImager~(TM) 2200型凝胶成像系统,美国Alpha公司产品。电泳仪POWER/PAC300型美国BIORAD公司。     

石蜡组织提取DNA 4种方法的比较

目前，从石蜡包埋组织中提取DNA在数量和质量上都不能令人满意^[1]。而按常规酚一氯仿法抽提DNA，过程长，有毒性，用于PCR扩增，成功率较低。我们应用4种不同方法从石蜡包埋人胃癌组织中提取DNA，用于PCR扩增，从中摸索出一个简便，经济，实用的方法，现报道如下。     

PCR试验加样过程中无DNA原则控制污染的探讨

目的　探究在PCR操作过程中如何预防污染的一些基本操作方法。方法　首先制定了PCR操作过程中的无DNA原则 ,对实验室的划分 ,操作总原则 ,Eppendorf管开、关 ,有螺旋的离心管开、关 ,装有反应体系Eppendorf管的放置 ,标记反应管的操作 ,移液器的使用方法等进行规范化 ,最大限度地避免DNA污染反应体系。然后通过扩增新鲜扁桃体组织中珠蛋白基因及模拟手套被质粒污染的情况下扩增质粒基因 ,验证该无DNA操作过程对避免污染的有效性。结果　按本实验的规范方法进行操作 ,所有阴性对照均未出现假阳性。结论　采用这种无DNA原则进行PCR操作 ,是控制反应体系污染的一种有效方法。     

Wipe Test在HLA组织配型实验室污染监测及预防管理中的应用

目的建立人类白细胞抗原(HLA)组织配型实验室常规DNA污染监测试验体系,预防和消除可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染。方法设计含多种阴阳性对照和各关键监测点的完整反应链,针对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因扩增区域内的非多态区进行引物特异性PCR,琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物;对被污染监测点进行局部灭活处理后对相应监测点重新采样进行灭活验证;同时采取不定期抽查监测与定期全面监测相结合的方式确保实验过程零污染。结果灭活处理及整改后,所监测HLA基因分型实验过程中的核酸抽提区、PCR加样区、PCR扩增区、下游产物处理区4个区域的主要监测点污染监测结果均合格。结论该研究建立的以Wipe Test为核心的DNA防污染监测实验体系能够有效监测和灭活验证可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染,是HLA组织配型实验室质量控制管理程序的重要组成部分。     

LAMP技术在医学检验中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated-isothermal-amplification LAMP)技术是近年来发展的一种灵敏、特异、快速的新型基因检测与核酸扩增技术,与传统的PCR方法相比,LAMP不需要热循环,为等温扩增,其检测结果可以通过加入核酸染料SYBR GREEN进行肉眼观察或浊度计即可判定结果.因此,LAMP是一种不需要热循环仪,肉眼即可判定结果的高度特异性,和敏感的DNA扩增技术,适用于现场,基层条件较差的实验室进行病原微生物的快速检测.本文就近年来LAMP/LAMP-RT技术在医学检测中的应用做一综述.     

性别位点在新生儿两性畸形诊断中的应用

小儿出生时，外生殖器含糊不清时，必须注意是否为两性畸形，医生应及早确定性别。手术纠正性别必须及早进行。DNA水平上的性别鉴定，在80年代后期主要用Y染色体特异性DNA探针印迹杂交法、限制酶Y染色体特异序列法进行鉴定，进入90年代主要采用PCR技术扩增Y染色体特异性片段鉴定性别，同步扩增X、Y染色体同源的特异性序列的方法来做性别鉴定，是目前性别鉴定PCR扩增产物最短的方法，具有灵敏度高、实用性强等优点．适合于不同条件的实验室。     

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP／UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV—DNA PCR扩增产物作为污染源，分别加至含dUTP／UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中，在荧光定量PCR仪上进行定量检测，从而得出含dUTP／UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1．最佳抗污染实验条件：UDG酶含量0．05U，消化时间37℃5min，灭活时间92℃1min；dUTPl00％代替dITP，四种底物浓度相等。2．含0．05U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为10^3拷贝／ml的污染物可完全消化，并随UDG含量的增高及消化时间的延长，抗污染能力增强。结论 dUTP／UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染，但抗污染能力是有一定限度的，尚需加强实验室标准化管理，才能真正达到抗污染效果。     

清除血清中HBV-DNA的方法比较

选择一种消除实验室DNA污染的最佳消毒方法。用压力蒸汽消毒、紫外线消毒、84消毒液、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠消毒液和2%(v/v)戊二醛消毒液,按常规方法对高浓度(5×107cop ies/m l)与低浓度(5×103cop ies/m l)HBV-DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行消毒处理,然后用PCR检测技术检测HBV-DNA浓度的变化。HBV-DNA阳性血清标本经84消毒液消毒后不能检出HBV-DNA;过氧乙酸、次氯酸钠和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒法消毒后HBV-DNA含量减少;压力蒸汽消毒法对血清标本中的HBV-DNA无作用。84消毒液能完全清除阳性血清标本中的HBV-DNA;高压蒸汽、过氧乙酸、次氯酸钠和2%(v/v)戊二醛及紫外线照射消毒法不能完全清除阳性血清标本中的HBV-DNA。     

纳米微球在核酸检测中的应用研究进展

核酸分析在遗传病诊断、病原微生物检测、法医鉴定、亲子鉴定以及环境监测等方面有广泛的应用。1986年Mullis等发明了PCR后，经过不断完善，现已成为核酸分析的一种常规技术。然而在实际应用中，扩增产物污染导致的假阳性结果一直困扰着人们，为了进一步提高结果的特异性并同时进行高通量分析，人们在PCR产物的杂交分析方面也取得了很多进展，     

多重PCR诊断线粒体突变聋病的临床应用价值

目的采用多重PCR和多重限制性内切酶法同时检测线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）1555^G、3243^G,7445^G三个突变位点，探讨多重PCR法在线粒体突变聋病中的诊断价值。方法收集311例耳聋患者外周血标本，提取DNA模板，以三对引物在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增；产物在同一体系中用三种相应的限制性内切酶分析，同时对扩增产物进行mtDNA基因序列测定。结果采用本法检测出mtDNA1555^G。点突变20例，7444^A点突变1例，结果与测序相符。结论多重PCR和酶切法可同时检测多个mtDNA突变位点，利用这一方法可快速简捷地诊断线粒体突变聋病，便于临床推广应用。     

基因扩增实验室的质量控制措施

聚合酶链反应(PCR)具有较高的敏感性和特异性,能够对核酸分子进行定性和定量检测[1],随着分子生物学技术的不断进步,PCR技术取得了前所未有的发展.实时定量PCR是一种新型先进的实时核酸定量方法,与常规的终点定量PCR技术相比,不仅有很高的灵敏度和特异性,而且操作简便,PCR基因扩增技术简单易行,应用日趋广泛[2],但其影响因素很多,在实践过程中时常出现这样或那样的问题,甚至得不到预期的结果,或出现无法解释的现象.近年来在大量科学工作者的共同努力下,取得了许多宝贵的经验,使这一技术日趋完善,毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术,许多问题至今仍然不能得到很好的解释或解决.相信随着对PCR的深入研究,在PCR的应用过程中不断总结经验,PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献.本实验室是多年来从事核酸临床检测的专业机构,结合国内外的实践经验,在实验室质量控制方面做了一些基础性工作,现论述如下,以供参考.     

聚合酶链反应检测SEN病毒的方法学探讨

目的探讨聚合酶链反应(PCR)扩增SEN病毒(SENV)核酸的优化条件。方法将标本分别以Acupure DNA／RNA提取法(方法1)、SDS-蛋白酶K方法(方法2)及裂解液提取’兀V核酸法(方法3)抽提SENV DNA模板，并用3组针对SENV DNA不同区的引物进行扩增，比较不同模板提取方法、不同扩增引物及不同体积标本对SENV DNA检出率的影响。结果在191份血清中，方法1、方法2和方法3提取核酸后可分别检测出15份、9份和7份。采用方法1提取SENV DNA的基础上，采用2组套式引物分别扩增出15份和11份，一次PCR引物仅检出2份SENV DNA阳性标本；应用引物2扩增至少需要50μl血清。结论不同引物扩增方法和不同模板提取方法可能是影响SENV DNA检出率重要因素。     

HBV DNA定量检测方法的评价

目的协助临床检验工作者及科研人员选择适合本单位实际条件的HBV DNA定量检测方法。方法采用核酸分子杂交、荧光定量PCR、微板核酸杂交三种方法对89例乙型肝炎大三阳患者进行HBV DNA测定。结果三种方法测定结果依次为荧光定量PCR法阳性89例，微板核酸杂交法阳性8l例，斑点杂交法阳性62例，三种方法均阳性61例。结论斑点杂交法准确性和特异性较高，适合于流行病学调查和药物观察等研究。荧光定量PCR技术灵敏度较高，若能提高其检测结果的准确性，它应为临床及科研之首选方法。微板核酸杂交技术有较高的灵敏度和特异性，操作简便，可常规普及。     

无菌器械暴露法与覆盖法对减少空气污染的探讨

针对基层医院手术室本身条件有限，各种消毒隔离措施不是十分完善的现实情况，2003年3月-2004年3月，对手术包内无菌器械受空气细菌的污染情况进行了实验室研究，以期找出在现有条件下减少污染的方法，现将结果报告如下。