补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增的调控作用

目的：比较补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增殖的调控作用。方法：采用含药血清对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理，观察四种中药对细胞寿命，细胞生长曲线，代谢活力（MTT法）以及衰老细胞生物学标志衰老相关半乳糖苷酶活力的影响。结果：补肾和益气方药能够明显延长衰老细胞的传代次数，促进细胞增殖，使细胞MTT的还原量明显升高，抑制细胞衰老相关半乳糖苷酸（SA-β-Gal）活力，而健脾、活血方药对细胞增殖的促进作用不明显。结论：细胞衰老时增殖变慢，活力降低，衰老相关半乳糖苷酶活力增高，补肾，益气中药能改善上述衰老变化，健脾，活血药作用不明显。     

补肾、健脾、活血中药对地塞米松诱导骨质疏松大鼠骨组织TRPV5表达的影响

目的:观察地塞米松诱导的骨质疏松大鼠骨组织新型上皮钙通道( TRPV5)基因和蛋白表达的变化,探讨糖皮质激素性骨质疏松症( GIO)的发病机制,并比较补肾、健脾、活血中药的疗效及其调控作用.方法:Wistar大鼠132只,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾组(1.139 g·kg-1)、健脾组(0.945 g·kg-1)、活血组(0.504 g·kg-1)和骨疏康组(2.1 g·kg-1).地塞米松im造模(2.5 mg·kg-1),每周2次,造模及给药连续9周.测定离体股骨骨密度(BMD),生化法测定血清骨代谢指标,实时定量PCR与Western -blot法测定骨组织TRPV5 mRNA和蛋白表达.结果:模空组大鼠BMD明显降低(P＜0.01),血清骨吸收标记物TRAP含量明显升高(P＜0.01),骨组织TRPV5 mRNA与蛋白表达均上升(P＜0.01);补肾中药能明显增加模型大鼠股骨BMD(P ＜0.01),降低大鼠血清TRAP含量(P＜0.01),下调骨组织TRPV5 mRNA与蛋白表达水平(P＜0.01或P＜0.05).结论:补肾中药通过下调骨组织TRPV5 mRNA与蛋白表达而抑制破骨细胞骨吸收,从而起到抗骨质疏松的作用,其疗效优于健脾与活血中药.     

黄芪和当归配伍对小鼠造血干细胞衰老模型细胞增殖的影响

研究黄芪和当归配伍对小鼠造血干细胞衰老模型细胞增殖能力的影响及其作用机制。大鼠灌胃给药制备含药血浆后,体外培养小鼠造血干细胞,实验设空白对照组、模型组、空白血浆组、芪归1∶1血浆组、芪归10∶1血浆组、单用当归血浆组、单用黄芪血浆组,以三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导小鼠造血干细胞衰老,以含药血浆作用于造血干细胞衰老模型。SA-β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老率,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Cyclin D1,P21,P53 mRNA表达,Western blot检测Cyclin D1蛋白表达。结果显示,t-BHP作用于造血干细胞后,可使衰老细胞增加,细胞增殖能力降低,G0/G1期细胞增多,G2/M+S期细胞减少,同时伴Cyclin D1表达降低,P53,P21表达增强。黄芪、当归、芪归1∶1配伍、芪归10∶1配伍含药血浆可降低衰老细胞阳性率,使G0/G1期细胞减少,G2/M+S期细胞增加,细胞增殖能力增强,并使Cyclin D1基因和蛋白表达增强,P53,P21基因表达降低。以上效应以芪归1∶1配伍的作用为强。结果表明,t-BHP可使造血干细胞衰老,细胞增殖能力降低。黄芪、当归及其配伍可抑制造血干细胞衰老,促进造血干细胞增殖和细胞周期转换,以芪归1∶1配伍的作用为强。其作用机制可能与其上调细胞周期正性调节因子表达,下调细胞周期负性调节因子表达,从而促进细胞由静止期进入增殖期有关。     

补肾、健脾、活血中药对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨组织Osterix mRNA及蛋白表达的影响

目的:观察糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)大鼠模型骨组织成骨细胞特异基因(osterix,Osx)mRNA及蛋白表达,探讨GIOP的发病机制,并比较补肾、健脾、活血中药的疗效及其调控作用。方法:采用后肢肌注地塞米松(2.5mg/kg,每周2次,连续9周)的方法复制GIOP大鼠模型,按体质量分层随机分为正常组、模型空白组、补肾中药组、健脾中药组、活血中药组、骨疏康颗粒阳性对照组。灌胃给药9周。应用XR-26型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度,以评价动物模型的成立及药物疗效。实时定量RT-PCR(real-time quantitative,RT-PCR)检测骨组织Osterix mRNA表达,Western Blot检测骨组织Osterix蛋白表达。结果:①股骨骨密度:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾中药组明显升高(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组明显升高(P<0.05),健脾中药组和活血中药组虽有升高趋势,但无统计学意义。②骨组织Osterix mRNA及蛋白表达:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾中药组明显上调(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组也有明显上调(P<0.05),健脾中药组和活血中药组虽有所升高,但无统计学意义。结论:①肌注地塞米松可以成功复制GIOP大鼠模型。②骨组织Osterix mRNA及蛋白表达水平降低可能是GIOP的发病机制之一。③补肾中药具有明显防治效果,其作用机制与上调骨组织Osterix mRNA及蛋白表达密切相关。     

补肾阴对胚胎干细胞活动的影响

目的观察补肾阴中药复方对胚胎干细胞活动的影响。方法选用胚胎干细胞模型CRL-1825细胞株,加入补肾阴中药复方大鼠含药血清,观察补肾阴中药对干细胞分化、凋亡、细胞周期及其关键基因表达的影响。结果补肾阴中药复方含药血清可以抑制干细胞的分化和凋亡,促进干细胞增殖以及细胞周期的进程,促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达,下调P16INK4a基因的表达。结论补肾阴中药复方可以促进干细胞增殖、维持其不分化状态。     

补肾中药复方对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨和肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达的影响

目的:观察糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)大鼠骨、肾组织同源异形盒基因5(Dlx5 mRNA)及蛋白表达,探讨GIOP的发病机制、补肾中药复方的疗效机制及其与健脾、活血中药复方及骨疏康颗粒的比较。方法:肌肉注射地塞米松复制GIOP大鼠模型,实验设正常组、模型组、补肾组、健脾组、活血组、阳性对照组。造模及灌胃给药9周。测定股骨骨密度,RT-PCR及Western Blot检测骨、肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组股骨骨密度明显降低(P0.01)、骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显降低(P0.01)、肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显升高(P0.01);与模型组比较,补肾组及阳性对照组股骨骨密度明显升高(P0.01)、骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显上调(P0.01)、肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显下调(P0.01)。结论:骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达降低、肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达升高可能是GIOP的发病机制之一;补肾中药复方可能通过上调骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达、下调肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达,有效防治GIOP。     

益气、补肾、活血、健脾四组方药对老年大白鼠肝脏形态学变化影响的比较研究

本实验分别用益气、补肾、健脾、活血四类不同的方药作用于老年大白鼠。21个月龄时,取其肝脏作组织学及组织化学的比较研究。结果显示:中药组肝脏组织结构的退化程度明显较老年对照组轻。其中以益气与补肾方药组的效果为佳,健脾与活血组较为逊色。中药组大白鼠肝脏中琥珀酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酶、三磷酸腺苷酶的变化均比老年对照组较为接近青年对照组。亦以益气、补肾组的效果最佳。揭示:益气、补肾中药有延缓大白鼠肝脏衰老的作用。     

黄芪、三七及其配伍对MNNG诱导萎缩性胃炎癌前病变大鼠Gli1/2/3、SUFU及CyclinD1水平的影响

目的探讨黄芪、三七及其配伍对萎缩性胃炎癌前病变大鼠神经胶质瘤关联癌基因同源物(Gli1/2/3)、丝氨酸激酶抑制物(SUFU)及细胞周期蛋白Cyclin D1水平的影响。方法雄性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、黄芪组、三七组、黄芪三七组、Purmorphamine组、环巴明组及叶酸组,每组10只。采用MNNG负荷多因素法制备萎缩性胃炎癌前病变模型,并给予相应药物治疗8周。Western blot及RT-PCR检测大鼠Gli1/2/3蛋白及基因水平。量子点介导的免疫荧光化学法检测SUFU及Cyclin D1蛋白表达。结果与空白组相比,模型组大鼠Gli-1 mRNA含量降低明显(P0.01),Gli-2及Gli-3蛋白含量均显著升高(P0.01),SUFU蛋白表达明显增强(P0.01),Cyclin D1蛋白表达明显减弱(P0.01)。与模型组相比,三七组可明显升高Gli-1基因表达(P0.05),降低Gli-2、Gli-3和SUFU的蛋白表达(P0.05,P0.01),黄芪三七组对Gli-3及SUFU的蛋白表达具有改善作用(P0.05,P0.01),而黄芪组仅能降低SUFU蛋白表达(P0.01),对其余指标均未见明显改善。结论活血药三七可影响萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜hedgehog信号通路中关键因子的表达,从而对萎缩性胃炎癌前病变起到防治作用。     

柴胡皂苷-D抑制宫颈癌Hela细胞的分子机制研究

目的:宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重影响女性健康。柴胡皂苷是中药柴胡抗炎、抗肿瘤等作用的主要成分,其中柴胡皂苷D效果尤为明显。研究探讨柴胡皂苷D对宫颈癌细胞的作用的分子机制。方法:采用CCK-8法检测柴胡皂苷D对Hela细胞增殖的影响,利用流式细胞仪检测柴胡皂苷影响Hela细胞凋亡和细胞周期,同时利用定量PCR法检测细胞周期及凋亡相关基因的表达水平。结果:与对照相比,柴胡皂苷D能够显著抑制Hela细胞的增殖(P0.01),通过流式细胞检测,发现柴胡皂苷D能够增加细胞凋亡比例(P0.05),将Hela细胞阻滞在细胞周期G1期。进一步实验发现,柴胡皂苷D能够降低周期素Cyclin D1和Cyclin E,进而影响细胞周期;同时增加凋亡促进基因Bax表达,降低凋亡抑制基因Bcl-2基因表达,从而影响细胞凋亡。结论:柴胡皂苷D通过周期蛋白阻滞Hela细胞周期停滞在G1期,通过影响凋亡相关蛋白诱导Hela细胞凋亡。     

肝癌全方及其不同治法拆方抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的作用

目的:探讨肝癌全方及不同治法拆方抗肿瘤作用的分子机制。方法:体外培养SMMC7721人肝癌细胞,分别给予2.5~100 g·L-1肝癌全方、清热方、活血方、健脾方干预24 h后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;分别采用1.25~20 g·L-1肝癌全方,5~20 g·L-1清热方和活血方及20~120 g·L-1健脾方干预24 h后,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测相关基因的表达;分别采用20 g·L-1肝癌全方和清热方,10 g·L-1活血方及120 g·L-1健脾方干预SMMC7721细胞24 h后,通过蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达,通过碘化丙啶(PI)/RNase staining solution试剂染色检测细胞周期的改变。结果:与空白组比较,肝癌全方及其不同治法拆方能抑制SMMC7721细胞的增殖,并呈现量效关系(P0.05)。与空白组比较,5~20 g·L-1清热方呈现量效抑制细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B(CDKN1B)基因表达(P0.05),20~120 g·L-1健脾方也呈现量效抑制CDKN1B基因表达(P0.05);5~20 g·L-1肝癌全方明显抑制糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)基因表达(P0.05),且量效显著;5~20 g·L-1清热方量效抑制SGK1基因表达(P0.05);20~120 g·L-1健脾方也抑制SGK1基因表达(P0.05),同时肝癌全方及清热、活血治法方可抑制SGK1磷酸化蛋白的表达(P0.05);1.25,20 g·L-1肝癌全方可促进叉头框蛋白O3(FOXO3)基因表达(P0.05);15,20 g·L-1清热方明显促进FOXO3基因表达(P0.05);20 g·L-1活血方促进FOXO3基因表达(P0.05)。与空白组比较,全方组G2期细胞数增加(P0.05),清热组和健脾组G2期细胞数增加更明显(P0.05);肝癌全方及不同治法拆方能够抑制细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)蛋白的表达,其中以健脾组抑制效果最显著。结论:肝癌全方及其不同治法拆方通过改变细胞增殖和周期,从而发挥抑制肝癌的作用。     

芒果苷对白血病K562细胞周期分布及细胞周期素A、细胞周期素B1表达的影响

目的：观察芒果苷对白血病K562细胞周期分布及细胞周期素A（CyclinA）、细胞周期素B（CyclinB1）表达的影响,以进一步探讨芒果苷抗白血病的分子作用机制。方法：应用流式细胞仪检测细胞周期的分布,用RT-PCR方法检测Cyclin A及Cyclin B1 mRNA表达水平。结果：芒果苷作用24 h后,K562细胞G2/M期细胞增多,出现G2/M期阻滞,并呈现剂量依赖性;Cyclin A mRNA和Cyclin B1 mRNA的表达随作用浓度的增加而逐渐增强,呈显著的剂量依赖性。结论：芒果苷阻滞白血病K562细胞周期于G2/M期,明显上调K562细胞Cyclin A和Cyclin B1 mRNA表达水平,芒果苷诱导K562细胞G2/M期阻滞可能是其抗白血病作用的分子机制之一。     

滋补肝肾,益气活血方药对血管平滑肌细胞增殖及相关基因表 …

目的：采用血清药理学方法研究滋补肝肾、益气活血方药对内皮素（ＥＴ）诱导的自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）和ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖及相关基因表达的影响。方法：采用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入实验检测ＶＳＭＣ增殖状态,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测中药血甭中ＶＳＭＣ诱导一氧化氮合酶基因和ＥＴ－诱导和ｃ－ｊｕｎ、增殖细胞怕（ＰＣＮＡ）基因表达活性的影响。结果：中导型一氧     

滋补肝肾、益气活血方药对血管平滑肌细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:采用血清药理学方法研究滋补肝肾、益气活血方药对内皮素(ET)诱导的自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及相关基因表达的影响。方法:采用3HTdR掺入实验检测VSMC增殖状态,应用Northern杂交、反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测中药血清对VSMC诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因和ET诱导的cjun、增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达活性的影响。结果:中药血清可明显抑制ET对VSMC的促丝裂作用(P<005);抑制原癌基因cjun和PCNA基因表达,促进iNOS转录。结论:滋补肝肾、益气活血方药通过调节iNOS和细胞增殖相关基因的表达活性进而阻止VSMC增殖。     

人参皂甙对不同代龄人胚肺成纤维细胞的增殖及Cyclin D1基因表达的影响

目的 :探讨人参皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞增殖及CyclinD1基因表达的调节作用 ,以进一步研究人参皂甙抗细胞衰老的机制。方法 :用体外培养的人胚肺成纤维细胞为细胞衰老模型 ,通过细胞流式分析、免疫组化及RT PCR方法 ,观察了人参皂甙对成纤维细胞的增殖周期、DNA合成 ,CyclinD1mRNA和蛋白质表达情况。结果 :衰老的成纤维细胞用人参皂甙连续处理 4代后 ,处于G1期的细胞数明显减少 ,进入S期的细胞由 16 7%增加到 33% (P <0 0 5 ) ;CyclinD1mR NA表达比对照组下降 ,CyclinD1蛋白质表达由原来的 77 1± 2 9明显下降为 5 2± 6 3(P <0 0 0 1) ,DNA合成增加 17% (P <0 0 5 )。人参皂甙对低代龄细胞的CyclinD1RNA合成有所增加 ,对CyclinD1蛋白质、DNA的作用影响不大。结论 :人参皂甙对人胚肺成纤维细胞具有双向作用 ,对高代龄细胞具有促进细胞增殖 ,调节CyclinD1基因表达的作用     

桂皮醛对NIH3T3细胞周期及相关蛋白表达的影响

目的：观察肉桂主要成分桂皮醛对小鼠成纤维瘤细胞株NIH3T3细胞周期及相关蛋白的影响。方法：采用流式细胞仪检测桂皮醛(5.5 ng ·mL^-1)对NIH3T3细胞周期分布的影响；用免疫细胞化学法检测桂皮醛对NIH3T3细胞的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和增殖细胞核抗 原(PCNA)蛋白表达的影响。结果：流式细胞仪检测显示,桂皮醛作用24 h后NIH3T3细胞S期比例上升了3%(P<0.05),G₂/M期比 例无明显升高,细胞增殖指数(PrI)增加了3.5%(P<0.01)。经桂皮醛刺激后,NIH3T3细胞Cyclin D1和PCNA蛋白表达量明显增加,与对照组 比较,有极显著差异(P<0.01)。结论：桂皮醛可推动NIH3T3细胞周期向前进展,这种正向调控作用与桂皮醛能促进Cyclin D1和PCNA蛋白 表达有关。     

新加归肾丸通过调节mTOR信号通路促进体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖

目的:观察补肾活血中药复方新加归肾丸对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。方法:体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,分为空白组,模型组,中药低、中、高剂量组共五组,空白组用1%胎牛血清培养基培养,其余四组滴加雷帕霉素,20 min后中药各组加入不同浓度的中药水提醇沉液。分别在培养24、48、72 h后采用流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化,并计算细胞增殖指数(PI); 免疫印迹法检测磷酸化-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、细胞周期蛋白D₂(Cyclin D₂)的表达水平。结果:用药24、48、72 h 这3个时段,中药各组S期细胞比率、PI均高于模型组(P<0.05),其中中药中剂量组最为明显(P<0.05)。用药24、48、72 h这3个时段,中药各个剂量组p-mTOR、Cyclin D₂表达水平均高于模型组(P<0.05)。中药各个剂量中以中药中剂量组效果最明显(P<0.05)。结论:补肾活血中药复方新加归肾丸能通过激活mTOR信号通路活性,上调Cyclin D₂蛋白表达,促使颗粒细胞由G₁期向S期转化,加速卵巢颗粒细胞周期进程,促进颗粒细胞增殖来实现改善卵泡发育。     

细胞周期蛋白G_1参与孕激素对子宫内膜基质细胞增殖作用的研究

目的在体外培养条件下,研究孕激素(P)对子宫内膜基质细胞(ESC)的增殖作用和细胞周期分布的影响及细胞周期蛋白G1(cyclin G1)的表达情况。方法分离小鼠ESC进行原代培养,采用四甲基氨唑蓝法(MTT)检测P处理后ESC的增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期各时相的分布,用细胞免疫化学技术检测cyclin G1蛋白的表达情况。结果孕激素对ESC起增殖作用,在一定范围内呈时间依赖性。孕激素作用12 h后,S期细胞百分数明显上调。雌激素(E)、孕激素(P)、雌激素+孕激素(EP)联合分别刺激ESC 24 h,P组和EP组的ESC增殖,S期的细胞百分数升高,且cyclin G1蛋白表达阳性。E组与空白对照组(C组)的ESC增殖抑制,S期的细胞百分数维持低水平,且cyclin G1蛋白表达阴性。结论孕激素对ESC起增殖作用,引起细胞周期重新分布可能是孕激素促ESC增殖的机制之一。cyclin G1呈孕激素依赖性表达,可能参与孕激素对ESC的促增殖作用。     

龟板含药血清对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察益肾龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖过程的增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。方法:使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经Brdu标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC增殖过程。用免疫组织化学方法和原位杂交方法检测MSC的PCNA及其mRNA表达;免疫荧光细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测PCNA蛋白表达的变化。结果:龟板血清以浓度依赖方式促进MSC的PC-NA及其mRNA表达阳性细胞数和PCNA蛋白表达,与对照组比较有显著性(P<0.05)。结论:龟板血清促MSC增殖作用可能与上调PCNA表达有关。     

细胞周期相关基因微阵列在中药抑制肝癌细胞增殖作用机理研究中的应用

目的 :设计DNA微阵列并利用其研究中药抗肿瘤的分子机制。方法 :制备了包含有与细胞周期和DNA损伤调控检测相关的 2 4个基因的cDNA微阵列 ,选择了本实验室已证明对肝癌细胞有抑制效果的中药 ,通过流式细胞仪检测其对细胞周期的影响 ,提取药物作用后的RNA ,反转录后标记探针与微阵列杂交 ,检测中药作用细胞后对细胞周期及损伤检测相关基因转录的影响。结果 :4种中药作用SMMC 772 1后 ,细胞周期基因和损伤检测点基因均有不同程度改变 ,表现为部分上调 ,部分下调 ,这些和流式细胞术检测的结果是相符合的。结论 :DNA微阵列技术为中草药治疗癌症的研究提供了可供参考的分子生物学依据。