反义寡核苷酸逆转大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)上特异位点的反义寡核苷酸对体外培养的大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的逆转作用。方法根据MDR-1基因的碱基序列设计合成硫代修饰的寡核苷酸,通过阳离子脂质体介导转染胶质瘤耐药细胞,应用流式细胞仪、RT-PCR等方法,对转染后的耐药细胞进行P-170、MDR-1mRNA水平的检测;用MTT法对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价寡核苷酸对多药耐药性的逆转效果。结果流式细胞结果显示转染后胶质瘤耐药细胞P-170表达明显低于转染前(P<0.05);RT-PCR可见转染后细胞的MDR-1mRNA水平减低;药物敏感性试验显示反义寡核苷酸转染后胶质瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性增强(P<0.05),含有脂质体的转染体系组对化疗药物的敏感性显著高于不含脂质体的转染体系组(P<0.01)。结论特异序列的反义寡核苷酸能够明显抑制大鼠胶质瘤细胞的P-170表达和减低MDR-1mRNA水平,进而对胶质瘤细胞的多药耐药性产生明显的逆转作用;应用阳离子脂质体作为转染载体可显著提高转染效率。     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。     

端粒酶反义寡核苷酸治疗脑胶质瘤实验研究

目的研究端粒酶反义寡核苷酸对胶质瘤细胞端粒酶活性、细胞增殖和细胞凋亡的影响,为以端粒酶为靶点治疗脑胶质瘤提供理论和实验依据。方法以端粒酶催化亚单位基因(hTERT)为靶点设计合成硫代磷酸化反义寡核苷酸(PS-ASODN),经脂质体(lipofectin)包裹转染胶质瘤细胞,每隔24h取样。采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测PS-ASODN对细胞生长增殖的影响;用端粒重复序列扩增-聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(TRAP-PCR-ELISA)法检测端粒酶活性的变化;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的改变。结果PS-ASODN实验组与正义组、错义组及空白对照组相比较,48h后细胞生长增殖受抑制,端粒酶活性降低(P<0.05),72h时,差异有高度显著性(P<0.01);实验组对细胞凋亡有显著的促进作用,细胞多阻滞于G2/M期。其作用具有序列选择的特异性,在一定的时间范围内,呈时间依赖性。结论端粒酶反义寡核苷酸能够有效地抑制胶质瘤细胞的生长而促进其凋亡,具有较好的临床应用前景。     

人脑胶质瘤多药耐药细胞株的构建及生物学特性鉴定

目的 体外构建胶质瘤耐甲磺酸伊玛替尼多药耐药细胞株,并研究其生物学特性。方法采用逐渐增加培养基中伊玛替尼药物浓度的方法诱导构建耐甲磺酸伊玛替尼的人脑胶质瘤U251细胞株(命名为U251 AR); CCK8法检测U251AR、U251对多种化疗药物的IC50和耐药指数;QRT-PCR法检测耐药相关基因ABCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA的表达,流式细胞术检测ABCG2蛋白的表达。 结果 体外培养12个月后建立了稳定耐药的细胞株U251AR,与亲代细胞相比异形性不显著。U251和U251AR对化疗药物的IC50相比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,U251AR对甲磺酸伊玛替尼、阿霉素、顺铂的耐药指数分别为20.41、5.06、10.28,表现出多药耐药特征。QRT-PCR检测结果显示耐药细胞株U251AR中ABCC1、ABCB1、ABCB4、ABCG2 mRNA的表达明显高于亲代U251细胞,流式细胞术检测结果显示U251AR中ABCG2蛋白的表达强于亲代U251细胞,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 成功建立多药耐药的胶质瘤细胞株U251AR,其多药耐药与A BCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA及ABCG2蛋白的表达上调相关。     

神经胶质瘤C6/VP16多药耐药细胞株的建立

目的建立神经胶质瘤C6细胞对依托泊苷(VP16)耐药细胞株C6/VP16,探讨其耐药的可能机制。方法采用浓度递增和短期大剂量药物诱导相结合的方法建立大鼠C6/VP16耐药细胞株;光镜下观察C6/VP16细胞株的形态学变化;细胞计数试剂盒-8检测C6/VP16细胞株对VP16、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、环磷酰胺(CTX)、替莫唑胺(TMZ)的耐药敏感性;westernblot检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达量变化。结果经过65代诱导培养,成功建立可操作的、重复性好的C6/VP16耐药细胞株。C6亲代细胞形态规则、大小均一,生长迅速,紧密生长,每2～3d传代;C6/VP16细胞株,突起增多,生长周期受抑制,生长变缓,每10～12d传代。VP16、TMZ、CTX、ADM和VCR作用C6亲代细胞的半生长抑制浓度(IC50)分别为(0.105±0.043)、(27.284±0.529)、(5.800±0.317)、(6.636±0.315)和(19.146±0.526)μg/ml,而作用C6/VP16细胞株的IC50分别为(0.943±0.052)、(33.251±0.288)、(32.943±0.215)、(35.251±0.126)和(35.604±0.426)μg/ml;VP16、CTX和ADM作用C6/VP16细胞株IC50较C6亲代细胞差异显著(P<0.05)。C6/VP16细胞株MRP1的表达量较亲代C6细胞明显增加(P<0.05)。结论 C6/VP16细胞株对ADM和CTX存在明显交叉耐药,而对TMZ和VCR无明显交叉耐药;多药耐药性是多种机制相互作用的结果,MRP1可能参与其中。     

胶质瘤细胞多药耐药研究进展

肿瘤细胞产生的多药耐药性是胶质瘤化疗的主要障碍。本文重点探讨了胶质瘤多药耐药的发生机制,逆转方法以及近年来的研究进展。     

胶质瘤多药耐药细胞系C6／adr的建立及其耐药性逆转的研究

目的 研究胶质瘤多药耐药（ＭＤＲ）的发生机理及逆转方法。方法 建立了Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系,经ＲＴ－ＰＣＲ及免疫组化染色分别研究了ｍｄｒ－１基因及Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的表达;采用ＭＴＴ药敏试验及ＨＰＬＣＡ测定细胞内阿霉素浓度的方法研究了异搏定、红霉素、潘生丁、Ｐ－ｇｐ单克隆抗体、复方丹参对ＭＤＲ的逆转作用。结果 Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系ｍｄｒ－１基因阳性,Ｐ－ｇｐ高度表达。异搏定（２～６μ     

环加氧酶-2对神经胶质瘤细胞株的多药耐药影响

目的 探讨环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)在人神经胶质瘤细胞株SHG44发生多药耐药过程中的作用和机制.方法 应用阿霉素浓度递增和间歇诱导法建立SHG44/ADM耐药株,采用过表达COX-2和COX-2特异抑制剂NS398分别干预SHG44/WT和SHG44/ADM细胞株,免疫印迹法检测COX-2和MDR-1的表达量,酶联免疫分析PGE2产生量,荧光分光光度计检测细胞内阿霉素浓度.结果 过表达COX-2增加细胞PGE2生成量,同时增加MDR-1表达和活性;NS398抑制细胞PGE:生成量,减少MDR-1表达和活性.结论 COX-2参与神经胶质瘤细胞的多药耐药.     

反义寡核苷酸治疗脑胶质瘤的研究进展

本文从癌基因、生长因子及其受体基因、细胞信号传导系统以及细胞周期调节物等几个方面,综述了反义寡核苷酸在治疗人类恶性脑胶质瘤中体外试验和动物模型研究的最新进展。     

胶质瘤多药耐药细胞系C_6/adr的建立及其生物学特性的研究

目的　为研究脑胶质瘤的耐药、机理及逆转 ,建立了C6耐阿霉素细胞株 (C6/adr)MDR细胞系。方法　采用逐渐增加药物浓度联合反复短期暴露法建立了C6/adr细胞系 ,并对其形态学、超微结构及生长特点进行了研究 ,流式细胞术对细胞周期分布及DNA与RNA含量的变化进行了分析 ,观察了其克隆形成率 ,并对染色体进行了分析 ,用RT PCR法、免疫组织化学及流式细胞免疫学方法研究了多药耐药基因mdr 1及其表达的P gp定性、定量研究 ,用RT PCR法对端粒酶的活性进行了研究 ,建立了该耐药株的动物模型 ,并对其耐药性进行了分析 ,采用MTT法分析了耐药谱。结果　HE染色C6/adr与C6相似 ,透射电镜畸形核多见 ,胞浆内有较多的线粒体、核糖体及滑面内质网 ;群体倍增时间 5 5 2h ;传代 2、 3天 ,C6/adrDNA指数及RNA指数无变化 ;细胞周期分布以G0 G1期为主 ,克隆形成率可达 5 5 % ;染色体众数多集中于 40～ 42条 ,以亚二倍体居多 ;mdr 1基因表达阳性 ,P gp含量为42 5 1%± 7 82 % ,P gp强阳性 ,主要位于细胞膜上 ,端粒酶呈强阳性 ;动物模型其形态学及P gp含量均无变化 ;该细胞株对ADM ,VM 2 6 ,VCR ,5 Fu ,VP 16 ,CDDP耐药 ,对MTX ,CCNU无耐药性。结论　该耐药细胞系C6/adr耐药表型主要为MDR 1,为研究脑胶质瘤的耐药、逆转提供     

胶质瘤多药耐药细胞系C6/adr的建立及其生物学特性的研究

目的　为研究脑胶质瘤的耐药、机理及逆转，建立了C     

注射维生素C治疗脑胶质瘤的实验研究

目的探讨维生素C治疗脑胶质瘤的作用机制,为胶质瘤的临床治疗提供实验室依据。方法制作大鼠C6脑胶质瘤模型。荷瘤7d后将Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,即对照组;维生素C低剂量组（2．0g／kg）;维生素C中剂量组（4．0g／kg）;维生素C高剂量组（8．0g／kg）;5-Fu组（20mg／kg）。于用药结束后次日处死各组小鼠,计算肿瘤体积和抑瘤率;流式细胞术检测各组肿瘤组织细胞凋亡率;免疫组化法检测各组肿瘤组织Ki-67蛋白表达情况。结果维生素C可抑制大鼠肿瘤生长,且呈剂量依赖性,实验组肿瘤体积与对照组相比有显著差异（P〈0.05）,维生素C高剂量组与5--Fu组肿瘤体积比较无统计学差异（P〉0.05）。维生素C可诱导大鼠肿瘤细胞凋亡,维生素C各组与对照组相比均有极显著性差异（P〈0.01）,维生素C高剂量组凋亡率高于5-Fu组（P〈0.05）。免疫组化法检测肿瘤组织细胞Ki-67蛋白表达中,维生素C各组与对照组相比均有极显著性差异（P〈0.01）,维生素C高剂量组与5-Fu组细胞凋亡率比较无统计学差异（P〉0.05）。结论维生素C在-定剂量范围内可抑制C6大鼠脑胶质瘤的生长,诱导肿瘤细胞发生凋亡是其机制之一;药理剂量的维生素C能降低C6大鼠脑胶质瘤细胞增殖活性,具有-定的抗肿瘤作用。     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型,观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型;待术后生长至3w和4w时行MRI检测;不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4.03w;对照组平均生存时间为3.88w;且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围,对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用,可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型，观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型；待术后生长至3w和4w时行MRI检测；不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4．03w；对照组平均生存时间为3．88w；且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围，对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用，可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

逆转大鼠胶质瘤细胞耐药性MRP1-SiRNA的筛选实验

目的拟筛选出能逆转大鼠胶质瘤多药耐药细胞株C6／VP16对依托泊苷耐药性的多药耐药相关蛋白1基因小干扰RNA（MRP1-siRNA）。方法人工合成4对靶向MRP1的siRNA分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4,以脂质体2000作为载体;以6-羧基荧光素标记转染siRNA的c6细胞评价转染效率;采用逆转录-PCR和免疫印迹分别检测MRP1mRNA和蛋白的表达。细胞计数盒-8试剂盒检测转染前后依托泊苷对肿瘤细胞的半生长抑制浓度（IC50）。结果与siRNA1、siRNA4相比,siRNA2、siRNA3对MRP1基因的抑制作用更明显。转染siRNA2前后,依托泊苷对C6细胞的半生长抑制浓度分别为（0．873±0．0462）、（0．0927±0．039）ug/ul,两者相较差异显著（P〈0．05）。结论siRNA2、siRNA3可以有效抑制MRP1基因的表达,并能逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。