小干扰RNA抑制人端粒酶逆转录酶基因对胃癌细胞增殖的影响

目的 应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,观察其对细胞增殖的影响.方法 hTERT基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法转染SGC7901细胞.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hTERT基因表达.TRAP-PCR法检测端粒酶活性、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖.结果 SGC7901细胞转染前后hTERT基因的表达强度分别为:转染pU6组平均表达量为6.5×105拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组平均表达量为4.1 × 104拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组平均表达量为5.4×104拷贝/μg RNA.转染pU6组与其余两组P值<0.01;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组和转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组P值>0.05.端粒酶活性下降,细胞生长速度明显减慢.结论 小干扰RNA能有效抑制SGC7901细胞中hTERT基因表达,hTERT基因表达下调影响SGC7901细胞增殖.     

RNA干扰沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响

目的 观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因对SW480细胞生物学特性的影响.方法 将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA (hTERT-shRNA)用脂质体转染法导人大肠癌细胞株SW480,实验分4组,每组设3个复孔,分别于转染后24、48、72 h,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达,免疫细胞化学法检测hTERT蛋白表达,PCR-TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,终端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法和透射电镜观察细胞凋亡变化及共聚焦显微镜观察线粒体膜电位(MMP)的改变.结果 转染后48 h hTERT-shRNA组hTERT mRNA相对表达量为0.32±0.03,hTERT蛋白表达的平均灰度值为209.60±17.10,端粒酶A450 ～ A630值为2.242±0.284,较其他对照组均明显降低(P＜0.05,P＜0.01);G0/G1期细胞为(49.37±1.63)％,增殖指数为(50.60±1.57)％,凋亡指数为22.2％,较其他对照组均明显增高(P ＜0.05,P＜0.01);凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,线粒体Rhodamine 123平均荧光强度为719.99±17.08,MMP水平显著下降(P＜0.01).结论 RNA干扰(RNAi)沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡.     

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。     

表达人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的增殖腺病毒对肝癌细胞的抑制作用

目的 观察表达人端粒酶逆转录酶小干扰RNA(hTERT-siRNA)的增殖腺病毒(ZD-hTERT)对人肝癌Bel-7402细胞增殖及凋亡影响.方法 ZD-hTERT、增殖腺病毒ZD-EGFP、表达hTERT-siRNA的增殖缺陷腺病毒Ad-hTERT、增殖缺陷腺病毒Ad-EGFP分别感染人肝癌Bel-7402细胞.Western blot法检测ElA表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测hTERT表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活;结晶紫染色法检测细胞毒作用;原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡.结果 感染ZD-hTERT、ZD-EGFP的Bel-7402细胞表达ElA;抑制hTERT表达作用依次为ZD-hTERT>Ad-hTERT>ZD-EGFP>Ad-EGFP;抑制Bel-7402细胞生长及细胞毒作用依次为ZD-hTERT>ZD-EGFP=Ad-hTERT>Ad-EGFP.感染ZD-hTERT、ZD-EGFP、Ad-hTERT、Ad-EGFP的Bel-7402细胞凋亡率(%)分别为(88.1±2.2)、(39.2±2.1)、(42.1±5.1)、(7.5±2.1),ZD-hTERT诱导凋亡作用最高(P<0.01).结论 表达hTERT-siRNA的增殖腺病毒能显著抑制人肝癌Bel-7402细胞hTERT基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶基因表达和活性的抑制作用及其增殖、凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞端粒酶基因表达、活性的抑制作用及对肾癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的siRNA(100nmol/L)转染肾癌7860细胞,采用RTPCR检测7860细胞端粒酶mRNA表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学TUNEL法检测细胞凋亡。结果hTRsiRNA处理组7860细胞端粒酶mRNA表达(40.7±1.5)%降低,端粒酶活性(32.7±2.3)%降低,细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%增加,凋亡细胞阳性率(39.4±0.6)%增加。分别与阴性siRNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论siRNA能抑制人肾癌细胞端粒酶mRNA表达及活性,进而抑制其增殖、促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。     

野生型p53基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶mRNA转录的影响

目的 研究野生型p53基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA转录及端粒酶活性的影响。方法 将含人野生型p53基因的pcDNA3—p53转染人胃癌细胞系BGG—823，通过半定量逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)检测转染后细胞hTERT基因mRNA的转录，聚合酶链式反应结合酶联免疫吸附(PCR ELISA)方法检测端粒酶活性。结果 转染野生型p53基因后48、72h BGC-823细胞的hTERT基因mRNA转录量由对照组的( )下降为( )和( )；转染前BGC—823细胞表达高水平的端粒酶活性(3．049)，而转染48、72h后的端粒酶活性分别为1．678和0．757。结论 野生型p53基因能够显著抑制人胃癌细胞hTERT基因mRNA的转录，通过下调hTERT、基因mRNA的转录来抑制胃癌细胞的端粒酶活性。     

端粒酶逆转录酶启动子联合CD自杀基因靶向杀伤人肝癌细胞研究

目的 利用肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导自杀基因CD表达,检测其促进5-FC对肝癌细胞系的杀伤作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术获得hTERT基因的启动子片段,将其连至SV40增强子序列后,并克隆到表达荧光素酶基因的报告质粒上,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系Bel-7402和人成纤维细胞HDF中的转录活性,同时将CD自杀基因连至该调控序列后,转染肝癌细胞Bel-7402,通过逆转录(RT)-PCR、噻唑蓝(MTT)比色法检测其作为肝癌基因治疗中肿瘤特异性靶向杀伤载体的可行性.结果 成功构建pGL3-SV40-hTERT载体和SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体,转染ST-CD载体后Bel-7402细胞表达CD基因,转染PGL3-SV40-hTERT质粒后Bel-7402细胞中hTERT启动子高表达,相对活性为354%.与未转染组比较,5-Fc对转染SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体的肝癌细胞Bel-7402的杀伤效应明显增强(F=27.831,P<0.01).结论 hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的转录活性,能有效地诱导CD自杀基因的表达.     

腺病毒介导的RNA干扰对大肠癌HCT116细胞株β-连环蛋白表达的抑制作用

目的 构建针对人β-连环蛋白(catenin)的腺病毒载体pAdHl-shβ-catenin-GFP,应用RNA干扰(RNAi)的方法,观察其在体内和体外对人大肠癌细胞株HCT116生长的抑制作用.方法 设计合成针对β-catenin的shRNA,并克隆至腺病毒表达载体AdH1-GFP上,制备针对β-catenin的腺病毒载体AdH1-GFP-shβ-catenin-GFP,与腺病毒骨架载体共转染293A细胞包装病毒,采用空斑法测定病毒滴度为5×109pfu/ml,感染HCT116细胞.应用Western bolt和报告基因检测HCT116细胞β-cmemn表达水平和转录活性,噻唑蓝(MTT)比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,建立软琼脂克隆形成实验观察肿瘤体外成瘤能力,同时建立裸鼠HCT116细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果 成功构建针对β-catenin基因的RNAi腺病毒表达载体,与AdH1-GFP组比较AdH1-shβ-catenin-GFP组在感染24 h和48 h HCT116细胞β-catenin表达水平和转录活性显著降低,细胞的增殖和克隆形成能力则下降50%(P<0.01).体内实验表明重组腺病毒载体介导的β-catenin shRNA明显抑制肿瘤生长(P<0.01).结论 腺病毒介导的RNAi技术可有效降低β-catenin在大肠癌细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体诱导人结肠细胞凋亡的研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)肿瘤细胞特异性表达载体,观察其对人结肠癌细胞凋亡的作用.方法 利用hTERT基因核心启动子和FADD基因片段,构建hTERT基因启动子调控FADD 的肿瘤细胞特异性表达载体.用脂质体转染法,将其分别转染人结肠癌细胞和正常细胞,观察人结肠癌细胞和正常细胞的端粒酶活性、细胞周期及凋亡.结果 hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体,在所检测的肿瘤细胞中具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.Colon320细胞、LoVo细胞、SW480细胞与WI-38细胞凋亡率在不同转染时间比较,差异有统计学意义(P均<0.01).WI-38转染pLNCX-hTERT-FADD与pLNCX-hTERT-GFP在24、48、72、96、120h凋亡率比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体可能是一种新的肿瘤治疗途径.     

小分子干扰RNA特异性抑制胃癌SGC7901细胞人端粒酶催化亚单位基因表达的研究

目的构建针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pU6-hTERT-siRNAs,观察其对胃癌SGC7901细胞hTERT基因的特异性抑制作用。方法采用报告基因质粒pCX-GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6(3300bp)质粒,设计合成针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列,构建SHi-pU6-GFP质粒。应用Lipofeetamine^TM 2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞、SGC7901细胞,并用荧光显微镜观察转染效果。设计合成针对hTERT的siRNAs,构建重组pU6-hTERT-siRNAs质粒。Lipofectamine^TM 2000介导pU6-hTERT-siRNAs质粒转染SGC7901细胞。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)定性和定量检测hTERT基因表达情况。结果质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRV和XbaⅠ酶切电泳后,前者出现3300bp和约300bp条带,而后者出现3300bp和约350bp条带,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒。K562细胞和SGC7901细胞中分别观察到转染pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。定性、定量检测SGC7901细胞转染pU6-hTERT-siRNAs组hTERT基因表达抑制。结论针对hTERT基因设计的siRNAs表达质粒可以特异性抑制SGC7901细胞hTERT基因表达。     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

RNA干扰靶向抑制表皮生长因子受体表达对大肠癌细胞增殖的影响

目的观察RNA干扰（RN加）技术能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的表达以及对细胞增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2；脂质体瞬时转染后24、48、72、96、144h实时荧光定量PCR（Real Time PCR）和Western blot检测EGFR表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，并绘制细胞生长曲线；分5组：A组：Lov0细胞组；B组：Lipofectamine2000组；C组：对照载体HK组；D组：pU6-EGFR-shRNA-1组；E组：pU6-EGFR-shRNA-2组。结果D组E组细胞转染shRNA后mRNA和蛋白表达降低，G0～G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，对数生长期延迟，以48h效果最显著，和A组B组C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；但随着时间的推移其干扰作用降低。结论两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达，阻滞更多的细胞位于Go～G1期，促进细胞凋亡而抑制细胞增殖。     

核糖核酸干扰抑制生存素表达诱导小鼠结肠癌细胞凋亡

目的筛选强效抑制生存素Survivin基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA),探讨Sur- vivin基因抑制对小鼠结肠癌细胞凋亡的影响。方法根据siRNA的设计规则和Survivin序列,设计3段侯选siRNA,聚合酶链反应(PCR)法制备表达框；将siRNA表达框与Survivin-绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达质粒(pSurvivin-EGFP)共转染293T细胞,24～48 h后根据荧光强度筛选强效siRNA；再制备其表达质粒转染小鼠结肠癌CT26细胞,应用实时荧光定量(FQ)-聚合酶链反应和蛋白印迹(Western blot)法分析Survivin基因的表达；DNA末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪(FCM)Annexin V/丙化碘锭(PI)双染色法检测细胞凋亡。结果筛选出1段高效抑制Survivin表达的siRNA,可使CT26细胞内Survivin mRNA拷贝数明显减少,抑制率为86．9%；蛋白表达水平亦显著降低；TUNEL检测显示转染48 h后RNA干扰组和对照组凋亡细胞数分别为(60．13±5．71)个和(5．47±0．63)个,两组差异有统计学意义(P＜0．01)；FCM检测转染后1、2、3、4 d凋亡细胞比率分别为2．1%、4．9%、11．7%和32．6%,对照组4个时间点凋亡率均低于1．5%,两组差异有统计学意义(P＜0．01)。结论siRNA能有效抑制小鼠结肠癌CT26细胞内Survivin基因表达并诱导结肠癌细胞凋亡。     

T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT

目的 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(Cellular FACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达.方法 以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7 RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时用酶联免疫方法检测hTERT及CEA作为比对.结果 64例结直肠癌患者血清hTERT阳性率是 45.3%(29/64),血清CEA阳性率是 57.8%(37/64);Cellular FACTT方法检测循环肿瘤细胞的hTERT检出率为81.3%(52/64).其检测的灵敏度与酶联免疫检测方法有显著差异P<0.01.结论 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较酶联免疫检测方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断.     

表达端粒酶逆转录酶siRNA的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用

目的 观察表达针对端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(hTERT siRNA)的溶瘤腺病毒(ZD55-hTERT)抑制肾癌移植瘤生长作用.方法 荷肾癌裸鼠随机分4组,每组8只.瘤体内分别注射ZD55-hTERT、增殖缺陷型腺病毒(Ad-hTERT)、溶瘤腺病毒ZD55-EGFP及磷酸盐缓冲液(PBS),每次注射病毒7×108pfu/只,连续注射3 d.注射后第7天,每组处死3只取肿瘤组织,免疫组织化学检测肿瘤hTERT、E1A表达及凋亡.第50天时处死动物测量肿瘤体积.结果 ZD55-hTERT、Ad-hTERT、ZD55-EGFP及PBS处理组肿瘤体积(mm3)分别为:124.1±27.5、609.0±102.5、499.8±77.1、1552.1±206.4,ZD55-hTERT处理组与各组之间差异有统计学意义(P<0.01).Ad-hTERT处理组肿瘤无E1A表达,ZD55-hTERT处理组E1A大量表达,表明病毒复制.ZD55-hTERT处理组肿瘤hTERT表达显著低于Ad-hTERT处理组,凋亡细胞阳性率均显著高于Ad-hTERT处理组.结论 表达hTERT siRNA的溶瘤腺病毒ZD55-hTERT具有更强的抑制肾癌生长作用.     

增殖及非增殖腺病毒载体介导的RNA干扰对肾癌细胞杀伤作用

目的比较荷载Ki67基因小干扰RNA（Ki67-siRNA）的增殖腺病毒ZD55-Ki67及非增殖腺病毒Ad-Ki67对肾癌细胞的杀伤作用。方法MOI=10的ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染肾癌786-0细胞，2d后收集细胞，蛋白印迹法检测E1A表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹法、免疫细胞化学法检测Ki67表达；原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡。4d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，7d后结晶紫染色法检测细胞毒性作用。结果感染ZD55-Ki67的786-0细胞表达E1A，感染Ad-Ki67的细胞不表达E1A。ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染的786-0细胞Ki67mRNA表达率分别为（37．9±2．3）％、（64．1±1．9）％；Ki67蛋白表达率分别为（42．5±2．4）％、（60．1±2．2）％；Ki67染色阳性率分别为（20．8±2．8）％、（32．3±2．5）％；786-0细胞存活率分别为（22．2±3．0）％、（60．4±3．4）％；凋亡率分别为（53．0±3．7）％、（35．3±2．5）％，两种病毒处理之间差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论ZD55．Ki67抑制786-0细胞Ki67表达及增殖、诱导凋亡及细胞毒性作用均显著优于Ad-Ki67。增殖腺病毒介导的RNA干扰杀伤肾癌细胞作用优于非增殖腺病毒。     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。