日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆和表达日本血吸虫BBC1（SjBBC1）基因，为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5．0引物设计软件自行设计引物，PCR扩增SjBBC1基因，将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后，亚克隆人pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp，与预期大小相符。将该基因克隆人原核表达载体pQE30，表达蛋白分子质量单位约为23．6ku，并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30／SjBBC1原核表达重组体载体，表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆和表达日本血吸虫BBC1(SjBBC1)基因,为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR扩增SjBBC1基因,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp,与预期大小相符。将该基因克隆入原核表达载体pQE30,表达蛋白分子质量单位约为23.6ku,并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30/SjBBC1原核表达重组体载体,表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫重组抗原基因的高效表达和特性鉴定

为了获得有效的保护性抗原分子，我们对已构建的日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库的免疫筛选中所获得的阳性克隆λＳｊ５１４的。ＤＮＡ插入片段进行ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ，得到高效表达克隆ｐＧＳｊ２４。经诱导表达生产出约２０ｋＤａ的分离表达产物，该特异性蛋白可被日本血吸虫免疫血清、感染兔血清和病人血清特异地识别，而且具有较强的免疫原性，可刺激动物产生较强的抗体反应。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶基因片段在真核表达载体中的克隆

目的：为了寻找新的预防日本血吸虫病的侯选疫苗分子。方法：设计合成引物,以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板,用PCR法扩增出丝氨酸蛋白酶（Sp）基因编码序列,其大小约450bp,将其克隆入pGEM－T载体,进行序列测定,并将Sp基因克隆入真核表达载体pBKCMV中。结果：PCR法扩增出SjSp基因编码序列,其大小约450bp,重组质粒pGEM－T－Sp和pBK-Sp经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为427bp的不完整开放阅读框,其与曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶（SmSp1）具有高度同源性。结论：本文首次报道了日本积压吸虫丝氨酸蛋白酶（SjSp）的部分基因编码序列,并克隆入了真核表达载体pBKCMV中,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因的表达

为了表达日本血吸虫大陆副肌球蛋白部分基因，作者用ＰＣＲ方法从日本血吸虫基因组ＤＮＡ扩增出这一副肌球蛋白部分基因，然后将该基因重组于质粒体ｐＢＶ２２０中，使其在大肠杆菌中表达。结果获得－３２ｋＤａ的表达蛋白。免疫印迹分析表明感染高兔血清可识别这一表达蛋白，该蛋白的纯化将有利于血吸虫病疫苗的进一步研究。     

日本血吸虫四跨膜蛋白6编码基因的克隆、表达与鉴定

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白。 方法 设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中,并用IPTG对该重组菌诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。 结果 PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a(+),经SDS-PAGE可见一条约28kDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,此蛋白可被血吸虫病兔血清所识别。 结论 本实验成功克隆日本血吸虫Sj-Tsp6 样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因片段在真核表达载体中的亚克隆

目的将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体 pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL 提取日本血吸虫成虫 RNA,RT-PCR 法扩增 GST 基因编码序列,将扩增产物连接 pGEM-T 克隆载体,再亚克隆到真核表达载体 pBK CMV 中。结果 RT-PCR 法特异性扩增出 SiGST 编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR 鉴定表明所构建的质粒 pGEM-T-GST 和 pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMN-GST 重组质粒的成功构建,为进一步表达 GST 及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

日本血吸虫弹性蛋白酶基因的克隆、表达及虫期特异性转录

目的 克隆和表达日本血吸虫弹性蛋白酶基因（SjCE-2b），纯化表达重组蛋白，并研究该基因在各虫期的转录情况。 方法 预测SjCE-2b基因的编码序列。绘制血吸虫尾蚴弹性蛋白酶家族成员系统进化树。用RT-PCR和蛋白质印迹（Western blotting）分析SjCE-2b基因在日本血吸虫各期转录的差异。将RT-PCR扩增得到的SjCE-2b基因亚克隆至载体pET28b，在大肠埃希菌中诱导表达得到重组蛋白rSjCE-2b，用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物，Western blotting分析其免疫原性。 结果 在虫卵、子胞蚴和成虫检测到SjCE-2b基因转录本（714 bp），表达的重组蛋白rSjCE-2b，相对分子质量约为Mr 31 000，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。构建了重组原核表达载体SjCE-2b/pET28b，并在大肠埃希菌中表达。纯化后的重组蛋白rSjCE-2b可被日本血吸虫感染的兔血清识别。 结论 在日本血吸虫虫卵、子胞蚴和成虫发现SjCE-2b基因转录本。SjCE-2b基因有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫钙磷蛋白基因的克隆、表达及其进化分析

目的 克隆和表达日本血吸虫钙磷蛋白基因，纯化表达产物。 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑出钙磷蛋白基因进行体外扩增，将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中进行表达，组氨酸标签亲和柱层析法纯化表达产物，并用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。然后用生物信息学方法对其结构域和功能作用位点进行分析和预测，并绘制该蛋白的进化树。 结果 构建了重组原核表达载体，并在大肠埃希菌中获得了表达。纯化的重组蛋白可以被日本血吸虫感染的兔血清识别。经生物信息学分析发现该基因的编码蛋白含有4个EF手型（exchange factor hand，EF-hand）功能结构域，另外具有3种潜在的功能作用位点，即2个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶II磷酸化位点和1个N-肉豆蔻酰化位点，属于II型（type-II）钙磷蛋白。 结论 日本血吸虫钙磷蛋白基因编码蛋白为钙结合蛋白，有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

一个定向克隆的日本血吸虫基因表达库

作者应用定向克隆的方法，将从日本血吸虫成虫mRNA合成的cDNA片段，重组入噬菌体λgtllSfi－Not的EcoRⅠ和NotⅠ双酶切点之间。所构成的基因表达文库的库容量为3．13×106重组子。经含有IPTG及X－Gal的颜色选择平皿测定，重组效率为100％。应用抗体探针法已从一部分文库中筛选出25个阳性克隆。从阳性克隆的进一步分析以及应用特定基因引物的PCR扩增，目前已分离出4个具疫苗保护潜能的蛋白编码基因，从而表明文库的质量比较满意。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16的克隆与表达

目的　克隆和表达日本血吸虫新的分泌蛋白Sjsp16的编码基因。　 方法　根据EST测序的结果设计引物 ,从含有Sjsp16基因的cDNA克隆中扩增得到该编码基因 ,亚克隆入原核表达载体 pET2 8中表达 ,然后用生物信息学的方法对蛋白结构功能进行预测。　结果　成功克隆和表达了日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16,生物信息学分析提示该基因编码蛋白的N端带有一个信号肽序列 ,是一个分泌蛋白 ,含有一个ML功能结构域 ,具有 4种潜在的功能作用位点 ,即 1个N 糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 3个肉豆蔻酰化位点。　结论　Sjsp16基因编码蛋白为具有脂质识别和结合功能的分泌蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病药物靶点或疫苗候选分子。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。　方法　通过PCR从质粒pcDNA3-SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T -1中 ,构建重组质粒pGEX-SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM109,转化子经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。　结果　获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX-SjCL1质粒。SDS-PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。　结论　SjCL1基因在大肠埃希菌中以融合形式得到表达。