CRMP-1 真核表达载体的构建

 目的构建人坍塌反应调节蛋白1（CRMP-1）CRMP-1基因表达载体,以研究CRMP-1 蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法
从购买的人胚肾细胞株293T 中提取总RNA,经过RT-PCR 方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅
读框（ORF）cDNA 序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24 中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。
以酶切和CRMP-1基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 的正确性。结果酶切鉴定和CRMP-1基因序列测定均证实
重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

真核表达载体pcDNA3-FHIT的构建及其在COS-1细胞中瞬时表达

目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH...     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

Caveolin-1基因PEGFP-N1真核表达载体的构建及表达

目的：克隆caveolin-1（CAV1）基因开放阅读框的cDNA序列,构建PEGFP—N1／CAV1的真核表达载体。方法：设计并合成带酶切位点及保护碱基的引物,RT—PCR法扩增caveolin-1基因,PEGFP—N1载体及caveolin-1基因片段进行限制性双酶切,电泳后回收切开的PEGFP—N1及caveolin-1片段,经连接反应后构建PEGFP—N1／CAV1真核表达载体。结果：PEGFP—N1／CAV1重组质粒经PCR电泳结果显示,得到一条在555bp的片段;重组质粒经限制性内酶切双酶切电泳结果证实,可释放一条在555bp的片段和4．8kbp的载体片段;重组质粒测序结果,经BLAST比对,100％符合;瞬时转染宫颈癌Hela细胞48h荧光显微镜及实时荧光定量PCR证实重组质粒在宫颈癌Hela中得到表达。结论：成功构建了同时携带有绿色荧光蛋白及G418筛选位点的PEGFP—N1／cAV1真核表达载体复合体。     

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞TNIP1基因表达

目的 探讨TNIP1 基因在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞中的表达情况,以及与SLE疾病活动指数(SLEDAI)、单核苷酸多态性(SNP)位点rs10036748的相关性.方法 收集61例SLE患者和66例正常对照的临床资料及血样,采用实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞中TNIP1 mRNA表达量;应用Sequenom MassArray技术对所有病例对照SNP rs10036748位点进行基因分型.结果 SLE患者TNIP1基因 mRNA表达低于正常对照组(P=0.000 4);TNIP1基因 mRNA表达水平与SLEDAI和SNP rs10036748基因型之间无相关性.结论 TNIP1基因在SLE发生中可能起着某种作用.     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

pEGFP-PDX-1真核表达载体的构建

目的：构建真核表达载体pEGFP-PDX-1，为基因水平研究PDX-1在肝干细胞定向分化中的调控机制提供理论参考。方法：参考分子克隆技术，采用PCR的方法从SK900/BLSCRIPT质粒中扩增PDX-1，同时将一个单个限制性酶切位点连接反应转变为以Hind Ⅲ和BamHⅠ为末端的双限制性内切酶位点连接反应，将PDX-1 cDNA定向插入pEGFP-C1的多克隆位点中，构建重组表达质粒pEGFP-C1-PDX-1，并对重组子进行SmaⅠ单个限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建了含有PDX-1 cDNA的真核表达载体pEGFP-PDX-1。结论：将PDX-1插入pEGFP-C1的C-末端，提高PDX-1在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PDX-1调控肝干细胞的定向分化机制具有重要的意义。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

小鼠OX40真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40的真核表达载体。方法从ConA活化的小鼠牌淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR方法，扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA，并将其克隆到PUCm-T载体，经PCR、酶切和测序分析证实，进而脂质体法转染HUVECS，G418筛选，RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株。结果构建的pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体经PCR、酶切和测序分析，证实该片段与GeneBank记载的小鼠OX40cDNA序列完全一致。筛选获得能表达小鼠OX40蛋白的HUVECs转基因细胞。结论成功构建小鼠OX40转基因细胞，该克隆细胞为进一步研究OX40分子的功能奠定了基础。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217的构建及表达

目的克隆人类ZNF217基因cDNA全长,构建ZNF217的真核表达载体,并在真核细胞中表达。方法采用RT-PCR技术从人HO-8910卵巢癌细胞总RNA中扩增ZNF217 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pMD19-Teasy,测序证实碱基序列无误后,再克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果序列测定证实克隆的ZNF217全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实ZN217正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-ZNF217。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达术

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板，经PCR获得Hath1-cDNA，将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，前者回收1065bp片断，后者回收大片断，再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5q细胞，挑选单克隆，提取质粒，将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体Lipofectarnine^TM2000转染HEK293T细胞，观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，该质粒能有效地转染HEK293T细胞，目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

CCNL1真核表达载体的构建及其在MDA-MB-231细胞中表达的鉴定

目的:构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAX Ⅰ -CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,鉴定其在MDA-MB-231细胞中的表达情况.方法:用PCR方法扩增得到CCNL-1基因,然后用EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切CCNL1基因,将其分别与pcDNA3.1(+)、pVAX Ⅰ和pEGFP-C1...     

mBMP-4真核表达载体的构建及表达

0　引言　骨形态发生蛋白 - 4(BMP- 4)具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力 .随着基因转染技术的应用 ,将外源基因转入靶细胞内 ,通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能 .本研究的目的是通过基因克隆和 DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的 BMP- 4表达载体 ,并观测外源基因在细胞内表达的情况 ,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础 .1　材料和方法1.1　试剂　质粒 pc DNA3和 p SPT- 18- m BMP- 4均由吕振华博士馈赠 ,Eco R I和 H ind III,T4DNA连接酶、…     

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达

目的克隆人CDH22基因并构建其真核表达载体。方法设计CDH22特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人CDH22cDNA,经T-A克隆,通过双酶切及测序鉴定,将CDH22克隆至pCDNA3/HA,构建人CDH22基因的真核表达载体pCDNA3/HA-CDH22,转染HEK293A细胞,用WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增出人CDH22全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pCDNA3/HA-CDH22真核表达载体,测序结果表明CDH22全长cDNA与GeneBank中CDH22序列完全一致,转染HEK293A细胞后,可检测出Mr约为86KD的目的蛋白,而免疫荧光细胞化学技术也检测到蛋白表达。结论获得人CDH22基因全长cDNA并成功构建了CDH22真核表达载体,证实pCDNA3/HA-CDH22转染HEK293A细胞后可表达HA-CDH22蛋白,为深入研究CDH22基因在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。