O-GlcNAc糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯

目的 :本文为进一步研究蛋白 O- Glc NAc糖基化修饰提供重要资源。方法 :为了探索制备纯化具有生物学活性的重组 OGT的有效方法 ,本文用大肠杆菌和 Hi5昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组 OGT。携带人 OGTc DNA的 PET32 a质粒在大肠杆菌中表达出带有 1个 S- Tag的重组人 OGT融合蛋白 ,然后用与 S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和纯化 OGT融合蛋白。结果 :其纯化的 OGT在电泳中显现单一条带并具有生物活性 ,但其活性在洗脱后丧失。在 Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝 OGT带有一 His6 tag,经镍离子螯合柱纯化后 ,其比活性达到 0 .88nmol· min- 1 · mg- 1 OGT。结论 :在这两个表达系统中制备重组 OGT各有利弊。     

糖基转移酶在改善天然产物成药性方面的应用

天然产物结构新颖、生物活性多样,是药物或药物先导化合物的重要来源之一。但是,目前仅有极少数的天然产物被开发成药,生物活性不佳、溶解度低或稳定性差等是造成其成药性不佳的主要原因。鉴于天然产物结构的复杂性,通过化学结构修饰提高成药性受到了极大的挑战和限制,因此,更加多元化的酶法结构改造逐渐成为天然产物结构修饰的重要手段之一。由于选择性强、效率高、反应温和等优势,基于糖基转移酶的酶法糖基化修饰在改善天然产物成药性方面展现出了良好的应用前景。本文概述了糖基转移酶及其在天然产物结构修饰中的应用和挑战,可为天然产物的新药开发提供一定的参考和借鉴。     

哮喘小鼠肺组织和肺T细胞β1,3-N-乙酰糖基转移酶的表达

目的研究支气管哮喘模型小鼠肺组织及肺T细胞中三种β1,3-N-乙酰糖基转移酶（Fringe）RFNG、LFNG、MFNG的基因和蛋白表达的特点,探讨Fringe是否与哮喘发病有关。方法使用卵白蛋白腹腔注射后雾化吸入法制备BALB/c小鼠哮喘模型,并设置生理盐水对照组。经Perco1及尼龙毛法分离获取肺T细胞。采用半定量RT-PCR检测两组小鼠肺组织及肺T细胞中RFNG、LFNG、MFNGmRNA表达;Westernblot检测两组小鼠肺组织中RFNG、LFNG、MFNG蛋白表达。结果两组小鼠肺组织及肺T细胞中均存在三种Fringe表达。哮喘组肺组织及肺T细胞的RFNGmRNA表达较对照组增加（肺组织：0.92±0.35比0.51±0.13,P〈0.01;肺T细胞：0.33±0.06比0.18±0.07,P〈0.01）;LFNGmRNA表达较对照组减少（肺组织：0.77±0.32比1.61±0.31,P〈0.01;肺T细胞：0.49±0.19比0.71±0.03,P〈0.01）。MFNG在肺组织中的表达无明显差异（肺组织：1.44±0.29比1.70±0.44,P〉0.05）,但MFNG在肺T细胞中的表达明显减少（0.11±0.03比0.52±0.18,P〈0.01）。肺组织中三种Fringe蛋白表达与肺组织的mRNA结果相似。哮喘组的RFNG蛋白表达高于对照组（1.17±0.04比0.68±0.07,P〈0.05）,MFNG蛋白表达在两者之间没有明显的差异（8.10±0.60比9.12±0.07,P〉0.05）,而LFNG的蛋白表达则低于对照组（4.11±0.38比6.41±0.11,P〈0.05）。结论三种Fringe的异常表达可能与支气管哮喘的发病有关。     

变形链球菌葡糖基转移酶基因在戈登链球菌中的表达

目的:通过探讨变形链球菌葡糖基转移酶基因在戈登链球菌中的表达,了解葡糖基转移酶对戈登链球菌生物学特性的影响。方法:携带的大肠杆菌链球菌穿梭质粒pZB1转化戈登链球菌,利用蛋白质免疫印迹技术确认葡糖基转移酶基因在转化株中表达,通过检测转化株菌落形态以及蔗糖依赖性粘附了解葡糖基转移酶对戈登链球菌生化特性的影响。结果:戈登链球菌的菌落形态由转化前的光滑型变为转化后的半粗糙型,转化菌株的蔗糖依赖性粘附较转化前明显降低。结论:变形链球菌的葡糖基转移酶在戈登链球菌中的表达增加了细菌之间的聚集,葡糖基转移酶与戈登链球菌的粘附因子相互作用,降低了细菌的蔗糖依赖性粘附。     

O-GlcNAc转移酶在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨氧连氮-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT）在原发性肝细胞癌（HCC）组织、细胞及血清中表达情况,阐明OGT在HCC的诊断和治疗中的意义。方法：采用Western blotting法分别检测20例HCC组织和癌旁组织中以及8例肝癌细胞株和正常人肝细胞裂解物中OGT蛋白表达水平,采用直接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测20名健康志愿者、肝硬化（LC）、HCC患者血清中OGT蛋白表达水平,分析HCC组织、细胞、血清中OGT蛋白表达水平与肿瘤发生发展的关系。结果：Western blotting检测,OGT在HCC肿瘤组织及相对应癌旁组织中均有表达,HCC患者肿瘤组织中OGT阳性表达率高于相对应癌旁组织（P < 0.05）;同时OGT在肝细胞癌株及正常人肝细胞裂解物中均有表达,而肝细胞癌株中阳性表达率高于正常人肝细胞裂解物（P < 0.05）。ELISA法检测,HCC和LC患者血清中OGT表达水平均高于健康志愿者（P < 0.05）。结论：OGT在HCC肿瘤组织中表达升高,OGT有望成为HCC新的诊断靶点。     

N—乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ和Ⅴ必要基团的研究

目的 研究化学修饰剂对Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ和Ⅴ活性的影响以探讨这两种酶的必要基因。方法 采用七种化学修饰剂分别修饰Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ和Ⅴ中的一些基团，用高效液相法测定酶的活性。结果 巯基、羧基、吲哚基和胍基祥修饰后，Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ活性丧失，而氯基、羧基和吲哚基被修饰后，Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ活性丧失。结论 结果表明羧基、吲哚基和胍基是Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ的必要基     

糖基转移酶基因β3GalT7／GnT8和β3GnT2在白血病细胞株及人骨髓有核细胞中的表达

目的: 从mRNA水平观察不同白血病细胞和人骨髓标本中糖基转移酶β3GalT7/GnT8和β3GnT2的表达情况. 方法: 采用RT-PCR技术,在8种白血病细胞株及24例白血病患者骨髓有核细胞中检测β3GalT7/GnT8,β3GnT2 mRNA水平的表达,以10例正常成人骨髓有核细胞作相对正常对照.结果: β3GalT7/GnT8在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937细胞和18例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1,Raji细胞和相对正常对照中没有表达;β3GnT2在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937,Raji细胞,4例相对正常对照和16例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1细胞中和6例相对正常对照中没有表达. 结论: β3GalT7/GnT8和β3GnT2与白血病的发生发展存在一定的关系,其mRNA的表达水平可以作为白血病早期诊断的一个标志.     

正、反义β1，4半乳糖基转移酶—I表达质粒的构建

目的：为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-1（β1,4-galactosyltransferase I, β-1,4-GalT-1）表达水平的生物学意义。方法；通过分子生物学手段，构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。设计β-1,4-GalT-I全长引物；提取小鼠脑总RNA，通过RT-PCR方法，得到全长β1,4-GalT-I基因片段，将其克隆到pGEM-T载体。再通过多克隆酶切位点，将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中。设计反义引物，以pGEM-β1,4-GalT-I质粒为模板，将P CR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果：通过酶切和测序证实，实验得到了正义、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。结论：正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建，为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础。     

O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化在正常肝脏及肝脏疾病中的作用的研究进展

O连接N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）糖基化是将O-GlcNAc连接到靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸位点上的一种蛋白质翻译后修饰,参与酶活性、蛋白稳定性、转录因子活性、蛋白质的亚细胞定位、分子之间相互作用等的调控。O-GlcNAc糖基化的异常与多种疾病相关,可能是一种全新的疾病治疗靶点。肝脏的生理稳态及各类疾病的发生、发展均与O-GlcNAc糖基化的失调密切相关。基于此,本文对O-GlcNAc糖基化在正常肝脏功能及非酒精性脂肪性肝病、肝细胞癌、肝损伤与再生中的作用的研究进展进行综述,旨在为肝脏疾病的治疗提供新思路。     

The Micro-determination of Serum Gamma-Glutamyl Transferase

ＴｈｅＭｉｃｒｏ－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｅｒｕｍＧａｍｍａ－ＧｌｕｔａｍｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅＺＨＥＮＨｏｎｇ－ｔａｏ（甄宏韬），ＴＡＮＳｈｅｎ－ｗｅｉ（谭慎微）（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ＴｏｎｇｊｉＨｏｓ...     

谷胱甘肽硫转移酶同功酶基因在食管癌组织中的表达

采用ＲＮＡ斑点杂交分析方法，对４０例食管癌组织和相对应的正常粘膜组织中谷胱甘肽硫转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴｓ）同功酶基因ＧＳＴπ、ＧＳＴα和ＧＳＴμ基因的表达情况进行研究，结果食管癌组织中ＧＳＴπ基因表达阳性率为７７．５％，在相应的正常粘膜组织中表达的阳性率为９０．０％。在食管癌组织中ＧＳＴα和ＧＳＴμ基因表达水平较低，表达阳性率分别为３５．０％和２０．０％，而正常粘膜组织中ＧＳＴα和ＧＳＴμ基因表达的阳性率分别为２０％和１５％，ＧＳＴｓ在癌组织中表达阳性率与正常粘膜组织相比，Ｐ＞０．０５。ＧＳＴπ基因表达阳性率明显高于ＧＳＴα和ＧＳＴμ基因，Ｐ＜０．０５。结果提示：ＧＳＴｓ同功酶基因在食管癌发生发展中基因转录水平增高，ＧＳＴπ是食管癌中ＧＳＴｓ同功酶存在的主要形式。     

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

目的:探讨Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法。方法:将Grb7蛋白SH2结构域编码基因与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签编码基因构建为融合基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点EcoRⅠ与XhoⅠ之间,挑选测序正确的质粒将其转染至BL 21感受态细胞内,感受态细胞于37℃摇培至其OD值达到0.6～0.8后,经0.2 mmol/L IPTG 25℃过夜诱导表达融合蛋白,MALDI-TOF质谱检测蛋白纯化产物,SPR生物传感器(Biacore 3000)检测纯化蛋白与天然配体磷酸化肽段的相互作用。结果:GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白在裂解菌液的上清液中存在,500 ml LB/Amp菌液可纯化得到415μg GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,MALDI-TOF质谱图上可见明显目的蛋白峰,Biacore 3000检测到纯化蛋白可结合不同浓度的磷酸化肽段配体。结论:运用改进的GST融合蛋白纯化方法可得到具有一定纯度及生物学活性的GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,为该蛋白结构域后续功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌鼠李糖基转移酶基因(wbbL)的克隆和表达

[目的 ]从结核分枝杆菌基因组DNA中克隆鼠李糖基转移酶基因 (rhamnosyltransferase ,wbbL) ,并利用 pET16b表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株中高效表达wbbL基因产物 -鼠李糖基转移酶。 [方法 ]利用PCR方法从结核分枝杆菌H 37Rv菌株的基因组DNA中扩增出wbbL基因 (90 6bp)并克隆到 pMD18-T克隆载体中 ,经DNA序列测定证实为正确的基因后 ,将其亚克隆到表达载体 pET16b中并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达wbbL基因产物。 [结果 ]1)从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA中PCR扩增出正确的wbbL基因 ;2 )经IPTG诱导wbbL基因在BL2 1(DE3)中高效表达出wbbL基因产物。 [结论 ]1)用具高保真性的LATaqDNA聚合酶所扩增的结核分枝杆菌的wbbL基因经BLAST分析与结核分枝杆菌基因组数据库 (http :/ /www .sanger .ac .uk)中所公布的序列完全一致 ;2 )从大肠杆菌BL2 1(DE3)所获得的大量鼠李糖基转移酶 ,为进一步纯化该酶并研究其酶促反应动力学特性提供了物质保障。     

血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的;获得具有高活性的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ表达,为进一步研究及应用奠定物质基础。方法：用ＰＣＲ法人纤维蛋白酶原ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ基因中,获得Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４）基因,测序验证后,将正确的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｋ１－４）序列,插入Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞ｓｆ９,表达Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ。结果：获得了正确序列Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

Purification of rat liver microsomal glutathione transferase

Summary The rat liver microsomal glutathione transferase was activated by N-ethylmaleimide, solubilized by Triton X-100 and purified by chromatography on hydroxyapatite and CM Sephadex C-50. A 28-fold purification resulted in a 38 % yield. The purified protein moved as a band with an apparent molecular weight of 14000 on sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and appeared to be nearly homogeneous. The N-terminal amino acid of the purified enzyme was alanine, identified by the dansyl method. Optimum pH and temperature were 6.8 and 30°C, respectively.     

O-GlcNAc糖基化对转录因子CREB活性和心肌细胞形态的影响

目的:研究心肌缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化是否通过促进转录因子CAMP反应元件结合蛋白(CREB)的活性而引起心肌细胞形态变化?方法:在HEK-293T细胞内过表达调控O-GlcNAc糖基化的酶O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和O-连接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA),Western blot检测细胞内的O-GlcNAc糖基化水平和CREB的磷酸化?原代培养大鼠心肌细胞,药物DON和PUGNAc改变细胞内的O-GlcNAc糖基化水平,光镜下观察细胞形态,Western blot检测细胞内的O-GlcNAc糖基化水平和CREB的磷酸化?结果:在HEK-293T细胞和原代培养的大鼠心肌细胞中改变O-GlcNAc糖基化水平,CREB磷酸化也随之改变,两者呈正相关?升高原代大鼠心肌细胞内的O-GlcNAc糖基化水平,心肌细胞数目减少,形态增大?结论:O-GlcNAc糖基化调节CREB的活性,两者呈正相关?心肌缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化很可能通过促进CREB的活性而引起心肌细胞体积增大密度下降,可能是导致心肌重构的重要原因?     

PSF真核表达载体的构建及细胞内表达和定位

目的构建小鼠多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子（PSF）真核表达载体并在小鼠Hepa1-6肝癌细胞内表达,观察PSF胞内定位及脂多糖（LPS）对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠PSF基因的蛋白编码序列;采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察PSF的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见PSF在Hepa1-6细胞内表达后只分布于细胞核,LPS刺激后PSF分布无明显变化。结论成功构建PSF真核表达载体,为研究PSF在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体;进一步证实PSF为定位于细胞核的核蛋白。     

依达拉奉对血管性痴呆大鼠学习记忆及胆碱乙酰转移酶和高亲和力胆碱转运体表达的影响

目的 研究依达拉奉对血管性痴呆(VaD)大鼠学习记忆及胆碱乙酰转移酶(ChaT)和高亲和力胆碱转运体(ChT)的影响.方法 30例大鼠随机数字法分为假手术组、模型组、依达拉奉治疗组,将假手术组双侧颈总动脉进行分离,不阻断血流,不注射药物.模型组、依达拉奉治疗组采用双颈总动脉永久结扎法建立大鼠血管性痴呆(VaD)模型.在3组造模后行Morris进行水迷宫测试,同时用免疫组化法检测大鼠海马ChaT及ChT表达.结果 Morris进行水迷宫测试结果显示:第1天模型组逃避潜伏期[(92.6±8.1)s]明显大于假手术组[(71.9±5.1)s]和依达拉奉治疗组[(71.2±4.9)s],差异有统计学意义(P＜0.05);第2,3,4天模型组逃避潜伏期[(85.9±9.8)s、(66.2±8.6)s、(68.9±7.4)s)明显大于假手术组[(51.9 ±4.9)s、(38.3±4.2)s、(21.1±2.9)s]和依达拉奉治疗组[(52.3±3.9)s、(37.5±3.9)s、(20.2±2.4)s],差异有统计学意义(P＜0.01);模型组穿越平台次数[(4.59±0.89)次]明显少于假手术组[(6.79±1.21)次]和依达拉奉治疗组[(7.21±0.89)次],差异有统计学意义(P＜0.05).3组海马ChaT灰度值比较:模型组(89.05 ±9.42)明显高于假手术组(67.44±6.36)和依达拉奉治疗组(62.35 ±4.69),差异有统计学意义(P＜0.05).3组海马ChT灰度值比较:模型组(145.33±3.79)明显低于假手术组(164.21±2.85)和依达拉奉治疗组(162.45±4.72),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 依达拉奉可有效改善大鼠的学习记忆能力,改善大鼠海马ChaT表达,ChT代偿性表达增高受到抑制.