血管内皮生长因子在骨形态发生蛋白-2诱导成骨细胞过程中的作用

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨过程中的作用。方法（1）取小鼠胚胎成骨细胞进行体外培养，RT—PCR法检测rhBMP-2（300ng／m1）诱导成骨细胞分化过程中VEGF受体（VEGF receptors，VEGF—R）的表达。（2）采用VEGF反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODNs）和苏拉明分别阻断VEGF的合成及功能，观察对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和钙结节形成的影响。（3）在rhBMP-2诱导成骨的同时，添加不同浓度的外源性VEGF，观察对成骨细胞体外矿化能力的影响。结果（1）VEGF—R（Flk-1和Flt-1）mRNA在成骨细胞呈稳定弱表达，rhBMP-2干预24h后VEGF—R的表达量无明显变化。（2）应用VEGF ASODNs和苏拉明可抑制rhBMP-2所诱导的ALP活性和钙结节形成，并存在剂量依赖效应。（3）单独应用VEGF并不能使成骨细胞分化为钙结节，外源性VEGF的加入亦不影响rhBMP-2刺激钙结节形成的能力。结论VEGF在成骨细胞可以自分泌的形式发挥作用，VEGF至少部分参与了rhBMP-2的诱导成骨活性。     

重组人BMP-2聚乳酸缓释纳米微球对体外培养兔成骨细胞增殖和矿化的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-2聚乳酸纳米微球缓释系统(rhBMP-2-PLA-Ns)对体外培养的兔成骨细胞的生物学效应. 方法 体外培养兔成骨细胞并鉴定,将rhBMP-2-PLA-Ns和第3代成骨细胞一起培养,免疫荧光法检测成骨细胞核中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,茜素红染色方法观察矿化结节的形成,Western blot检测rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞自分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用,并与单纯rhBMP-2组和空白组进行比较. 结果 培养5 d后,各组PCNA阳性细胞差异无统计学意义.培养10 d后,rhBMP-2-PLA-Ns组阳性细胞数明显高于单纯rhBMP-2组和空白组,表明rhBMP-PLA-Ns能够明显促进PCNA在成骨细胞核中的表达.与其他两组比较,rhBMP-2-PLA-Ns能显著促进矿化结节的形成(P<0.05);对Western blot检测结果进行半定量分析显示:三组成骨细胞均有VEGF的自分泌,加入rhBMP-2-PLA-Ns成骨细胞自分泌VEGF的量超过单纯rhBMP-2组以及空白对照组(P<0.05).结论 rhBMP-PLA-Ns有较好的生物学活性,能促进成骨细胞的增殖、矿化和VEGF自分泌的增加,具有一定的临床应用价值,为加快骨创伤的愈合提供了新的思路.     

血管内皮生长因子在放射损伤小鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 探讨辐射对小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及凋亡率变化。方法 采用RT—PCR和Western blot方法，初步检测了昆明小鼠经6．0Gy^60Coγ射线全身照射后小同时间骨髓基质细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平的变化；并用流式细胞术检测相应时间的骨髓基质细胞凋亡率。结果 辐射损伤后，小鼠骨髓基质细胞VEGF表达在mRNA水平和蛋白水平均显著降低，骨髓基质细胞凋亡率显著升高；随时间延长，骨髓基质细胞VEGF表达有所恢复，凋亡率也逐渐降低，但14d时仍未恢复正常。结论 6．0Gy^60Coγ射线可抑制骨髓基质细胞VFGF表达，引起细胞凋亡。说明辐射所致骨髓微环境损伤与基质细胞中VEGF表达异常有关。     

创伤后单核巨噬细胞集落刺激因子调控新生血管化的分子机制

目的 观察创伤愈合过程中单核巨噬细胞集落刺激因子(granuiocyte/macrophage colony - stimulating factor,GMCSF)经ERK通路活化核因子(nuclear factor,NF) - Κb诱导创伤后人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs）生成血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探讨相关机制。方法 分离培养创伤部位HDFs,并用GMCSF处理。作用不同时间后,采用RT - PCR和ELISA分别检测HDFs VEGF Mrna和蛋白水平;应用GMCSF作用HDFs后,采用Western blot观察ERK磷酸化水平的改变;进一步应用ERK通路特异性抑制剂PD98059预处理HDFs。再用GMCSF刺激已预处理过的细胞,收集细胞和上清液,采用Western blot检测VEGF蛋白水平的变化;进一步通过抑制ERK信号通路,采用免疫荧光检测NF - Κb的活化。另外,应用核质抽提试剂盒分离胞质和胞核,采用Western blot检测NF - Κb的活化。结果 随着GMCSF浓度的增加,VEGF Mrna及蛋白水平也逐步增加,呈一定的剂量依赖性;GMCSF作用于HDFs 2 h后,VEGF Mrna水平开始升高,至4～6h达到峰值。GMCSF能够显著活化ERK磷酸化过程;与GMCSF组相比,ERK信号通路特异性抑制剂PD98059能显著抑制GMCSF诱导VEGF的表达(P＜0.05)。免疫荧光和Western blot结果显示,抑制ERK后NF - Κb的活化受到显著抑制。结论 GMCSF可通过ERK信号通路活化NF - Κb从而诱导HDFsVEGF的表达。     

电离辐射对原代成骨细胞M-CSF表达的影响

目的 研究辐射对于原代成骨细胞巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）表达的影响,进而研究辐射导致骨损伤的分子机理。 方法 采用原代骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞,经0、2、4 Gy 137Cs γ射线照射后,采用实时定量PCR以及Western blot方法检测辐射对M-CSF mRNA和蛋白表达水平的影响。 结果 2 Gy和4 Gy γ射线照射均能引起成骨细胞M-CSF mRNA（t=-17.329, P < 0.01;t=-3.841, P < 0.05）和蛋白表达水平上调。4 Gy照射后则会导致成骨前体细胞M-CSF mRNA表达水平上调（t=-4.478, P < 0.05）,但与对照组比较,两者的蛋白表达水平未见显著差异。 结论 2 Gy和4 Gy γ射线照射后,成骨细胞M-CSF表达水平上调能增强核因子κB受体活化因子配体对破骨细胞分化、成熟的促进作用,有助于增强破骨细胞的骨吸收能力。     

rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨的影响及BMP-4的表达

 目的 通过观察兔下颌骨牵引成骨过程,探讨不同剂量重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)在不同时间对成骨区新骨生成的影响及其BMP-4的表达.方法 日本大耳白兔48只行单侧下颌骨牵引,分别将不同剂量 rhBMP-2胶原复合物植入骨切开处,间歇期5 d,牵引速度0.4 mm/d,2/d,共牵引5 d.用免疫组化方法观察牵引成骨新骨生成区BMP-4在固定1、7、14、28 d时的表达及新骨生成情况.结果 随着稳定期延长,牵引间隙内新骨逐渐生成.1.5 mg BMP-2剂量组的新骨生成优于对照组,3 mg BMP-2剂量组的新骨组织在同一时期内最多.BMP-4主要定位于成骨细胞和软骨细胞中,表达高峰出现在稳定期的1、7 d,此后逐渐下降,第28天阳性表达微弱.结论 rhBMP-2能促进牵引成骨,并具有浓度依赖性,BMP-4可能在牵引成骨的早期发挥重要作用.     

随机回转模拟失重对成骨细胞MACF1表达和β-catenin信号通路的影响

目的研究随机回转(RPM)模拟失重条件对微管微丝交联因子1(MACF1)表达及β-catenin信号通路的影响,为失重性骨丢失机制研究提供实验依据。方法 RPM条件培养成骨细胞,PCR检测MACF1mRNA表达变化,Western blot检测MACF1以及不同磷酸化位点β-catenin蛋白表达变化,荧光素酶报告基因检测细胞β-catenin荧光素酶活性变化。结果 RPM模拟失重条件下,成骨细胞MACF1表达下降,β-catenin mRNA和不同位点磷酸化蛋白表达量发生改变;MACF1 shRNA抑制了成骨细胞中β-catenin表达,影响了β-catenin蛋白稳定性及活性。结论 RPM模拟失重抑制了MACF1表达和β-catenin表达及活性;MACF1 shRNA影响了β-catenin表达及活性。MACF1可能是一种力敏感分子,通过调控β-catenin参与成骨细胞对力学信号的感知和响应。     

腺病毒介导的VEGF-B基因促血管内皮细胞增殖作用的研究

为观察腺癌毒素介导的血管内皮细胞生长因子B（VEGF－B）基因体外转染对血管内皮细胞的促增殖作用，构建编码人VEGF－B基因的复制缺陷的重组腺病毒载体，体外转染鼠主动脉血管内皮细胞（RAECs），应用RT－PCR和Western blot检测外源VEGF－B的表达，应用四唑盐（MTT）观察转染后RAECs的增殖。结果发现，RAECs可有效地被重组腺病毒载体感染，并能成功转录和表达VEGF－B基因和蛋白，在转染后细胞培养上清中检测到VEGF－B蛋白的表达，对RAECs有显著促增殖作用。提示重组腺病毒载体介导的人VEGF－B基因有血管新生作用，可用于缺血性心脏病的治疗。     

常压模拟高住低练对大鼠心肌血管内皮生长因子基因表达的影响

目的 :探讨常压下不同低氧 ( 1 4 5 %、1 2 6%氧含量 )模拟高住低练对心肌血管内皮生长因子mRNA表达的影响 ,为运动与低氧适应提供理论依据。方法 :用RT -PCR技术检测大鼠心肌VEGFmRNA水平。结果 :常压下不同低氧模拟高住低练对大鼠心肌VEGFmRNA表达作用结果不同 ,常压下 1 4 5 %氧含量 (相当于海拔 3 0 0 0m)模拟高住低练能稳定VEGF的上调 ,而在常压下1 2 6%氧含量 (相当于海拔 40 0 0m)模拟高住低练时VEGFmRNA基因表达量却减少。结论 :只有选择在适宜的氧含量 (海拔高度 )进行高住和安排好运动训练持续时间 (低练 )才能有效地提高大鼠心肌VEGFmRNA的表达水平     

α-生育酚对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响及机制

目的研究α-生育酚对TRAIL凋亡诱导作用的影响及机制。方法采用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞仪检测胃癌细胞SGG7901和MKN28的细胞周期及凋亡率;Western blot检测凋亡相关基因NF-κB、bcl-2和Survivin的表达。结果单用TRAIL 300ng／ml作用24h,胃癌细胞SGC-7901和MKN28的凋亡率分别为11．80％和36．05％;单用廿生育酚60μmol／L作用24h,SCG-7901和MKN28细胞的凋亡率分别为8．5％和9．0%。α-生育酚60μmol／L与TRAIL 300ng／ml联用24h后,SGG-7901和MKN28细胞的凋亡率分别升高至48．1％和63．7％。Western blot显示TRAIL可使SGC-7901和MKN28细胞survivin及NF-κB表达下调,但对bcl-2的表达无影响;α-生育酚对bcl-2和survivin的表达无明显影响;TRAIL与α-生育酚联用可使细胞中NF-κB、survivin和bcl-2的表达均明显下调。结论α-生育酚可增强TRAIL对胃癌细胞的凋亡诱导能力,其机制可能与survivin、NF-κB和bcl-2的表达下调有关。