二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 建立二重实时聚合酶链反应（duplexreal-timePCR）快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。方法 采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc，经熔解曲线分析鉴定产物。结果 所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现；当MRSA菌浓度达10^2cfu／ml时就可检出。在131株金葡菌中，30．53％（40／131）耐药；二重实时PCR扩增mecA基因29．01％（38／131）阳性，nuc基因100％阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100％。结论 对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。     

多重聚合酶链反应快速鉴别葡萄球菌及mecA基因检测

目的：建立快速鉴定葡萄球菌及检测mecA基因的多重聚合酶链反应（PCR）诊断方法。方法：以葡萄球菌16SrRNA、金黄色葡萄球菌的nuc基因以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因合成3对引物，采用多重PCR扩增法，快速鉴定葡萄球菌，同时判断MRS菌株。结果：107株葡萄球菌的16SrRNA基因扩增片段全部为阳性．与常规鉴定结果符合率为100％；nuc基因阳性48株。阴性59株，与金黄色葡萄球菌核酸酶试验一致；以PBP2a乳胶凝集试验结果为金标准，苯唑西林（含2％NaClMHA）及头孢西丁纸片扩散法的敏感性为98．7％和100％，特异性分别为75．0％和82．1％：PCR扩增法的敏感性和特异性均为100％。结论：多重PCR法能快速准确地从临床分离菌株中鉴别葡萄球菌，并可同步对mecA基因进行准确检测。     

耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的检测

为检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因,准确和快速鉴定临床分离的MRS,将临床分离的161株葡萄球菌应用PCR扩增法鉴定MRS的mecA基因,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果表明,161株葡萄球菌用苯唑西林纸片扩散法和mecA基因法检测MRS,4株菌有差异,mecA基因法鉴定阴性耐苯唑西林纸片扩散法鉴定为耐药株;3株纸片扩散为临界耐药,mecA基因法鉴定阳性,两种方法的符合率是97．52％。结论：mecA基因检测技术可以准确、快速判定MRS,特别是在鉴定纸片扩散法临界耐药株具有优势。     

3种鉴定耐甲氧西林葡萄球菌方法的比较

目的比较琼脂稀释、纸片及基因检测法鉴定甲氧西林耐药葡萄球菌的方法。方法按2004年美国临床实验室标准化委员会推荐的头孢西丁纸片扩散(K-B)法、琼脂二倍稀释(MIC)法,从中筛选出表型耐甲氧西林葡萄球菌(MRS),再将受试的葡萄球菌进行多重聚合酶链反应的体外扩增检测mecA基因。结果从临床分离的180株葡萄球菌中,mecA基因阳性葡萄球菌98株,其中金黄色葡萄球菌(SA)mecA基因阳性26株,阳性率为36.1%;凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)mecA基因阳性72株,阳性率为66.7%,mecA阳性的MRS只对万古霉素、替考拉宁敏感。结论mecA基因的PCR检测能够尽早准确诊断,便于及时治疗MRS造成的感染。     

医学成果

一项耐甲氧西林葡萄球菌临床检测研究 中国医科大学微生物学教研室娄金丽等人为了探讨沈阳地区耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的感染情况及流行特征,应用MRS鉴别培养、聚合酶链反应产物的酶联检测及常规药敏试验法,从76株葡萄球菌中检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)10株,耐甲氧西林、血浆凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)13株。10株MRSA的血浆凝酶型别主要集中在Ⅳ型,Ⅱ型次之。 结果表明,沈阳地区耐甲氧西林葡萄     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较

目的 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测方法进行比较.方法 分别用mecA基因PCR扩增法、PBP2a胶乳凝集试验法、头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林纸片扩散法对临床分离的135株金黄色葡萄球菌进行榆测.结果 mecA基因PCR扩增法显示阳性79株,阴性56株;PBP2a胶乳凝集试验法的敏感性和特异性分别为96.2%和100.0%;头孢西丁纸片扩散法的敏感性和特异性分别为94.9%和96.4%;苯唑西林纸片扩散法的敏感性和特异性分别为94.9%和62.5%.结论 PBP2a胶乳凝集试验法和头抱西丁纸片扩散法与mecA基因PCR扩增法的检测结果高度一致;苯唑西林纸片扩散法特异性低,不再适用于MRSA的检测.     

湖北地区2003-2004年葡萄球菌临床分离株的耐药性监测

目的：了解湖北地区葡萄球菌临床分离株的分布及其对常用抗菌药物的耐药率。方法：采用纸片扩散法检测1600株金黄色葡萄球菌和2596株凝固酶阴性葡萄球菌对11种抗菌药物的耐药性。结果：共检出甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌824株，分离率为51．5％；检出甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌1896株，分离率为73．03％。耐甲氧西林对庆大霉素、环丙沙星、克林霉素的耐药率分别为77％、91％、88％，比耐甲氧西株凝目酶阴性葡萄球菌对上述3种抗菌药物的耐药率28％、66％、56％均高，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对复方磺胺甲嗯唑及氯霉素的耐药率较金黄色葡萄球菌为高。甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌对环丙沙星、复方磺胺甲嗯唑、四环素、氯霉素的耐药率较甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌为高。但仍对庆大霉素、环丙沙星、氯霉素、克林霉素表现出较好的抗菌活性。结论：湖北地区葡萄球菌耐药现状不容忽视，加强对葡萄球菌耐药性的监测，并根据药敏试验结果合理使用抗菌药物对控制感染及防治耐药菌的传播非常必要。     

金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

目的：了解金黄色葡萄球菌感染的分布与耐药情况,为临床合理使用抗菌药物提供病原学调查及实验室依据。方法：收集临床分离的金黄色葡萄球菌,培养鉴定按《全国临床检验操作规程》进行,药敏试验采用纸片扩散法（K-B法）。结果：检出的金黄色葡萄球菌以痰标本为主,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率为66.4%,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）为33.6%;MRSA对常用抗菌药物的耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌,未检出耐万古霉素金黄色葡萄球菌。结论：加强临床金黄色葡萄球菌耐药情况监控,根据药物敏感试验合理用药十分重要。     

100例静脉插管感染病原菌分析

目的探讨静脉插管感染病原菌分离及耐药情况。方法静脉插管标本培养及血培养使用全自动生化仪;微生物鉴定及药敏使用全自动微生物鉴定系统。结果 2小时内100份标本全部得到阳性结果,24小时分离率69.5%。在球菌感染中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌占90.9%,耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌占71.2%。结论静脉插管院内感染病原菌耐药情况严重。     

耐甲氧西林葡萄球菌的药敏分析

目的 探讨我院有关病房葡萄球菌对甲氧西林的药敏情况。方法 对1998年住院患儿的临床标本培养,采用K-B纸法进行常用抗生素药敏实验。结果 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE),耐甲氧西林腐生葡萄球菌(MRSS)的发生率分别为54.4％、60.5％、60.6％。结论 以新生儿检出率最高。     

引物标记技术的应用与葡萄球菌多重耐药基因检测法的建立

目的 基于多重基因遗传信息表达分析系统(GeXP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法。方法 设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经“PCR+琼脂糖电泳”筛查2014年1月—2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR。用CY5标记上游引物5'端,制作GeXP多重PCR引物。应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR。应用优化后的GeXP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果。结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA)。16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段。建立的GeXP多重PCR能同时检出所有靶基因。43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡ Compact System)相符;与“PCR+琼脂糖电泳”相比：sat4符合率为97.67%(42/43),无统计学差异(P＞0.05);msrA符合率为95.35%(41/43),无统计学差异(P＞0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100%(43/43)。结论 采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高。     

Rapid detection of methicillin resistance in staphylococci using a slide latex agglutination kit

The slide latex agglutination test, MRSA-Screen, was compared with the mecA polymerase chain reaction (PCR) and traditional susceptibility test methods for the detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. The MRSA-Screen test detected the same number of methicillin-resistant S. aureus as the mecA PCR and the traditional susceptibility tests. It correctly identified all 21 methicillin-susceptible S. aureus as being sensitive. It also produced the same result as the mecA PCR in identifying a methicillin-resistant S. aureus among six isolates classified as borderline resistant by traditional susceptibility tests. The MRSA-Screen test and mecA PCR detected methicillin resistance in 10 and 15 of 17 methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, respectively. From these results, it is concluded that the MRSA-Screen is a very accurate, reliable and rapid method of detecting methicillin resistance in S. aureus and is suitable for use in clinical microbiology laboratories. Further study of its use in detecting methicillin resistance in coagulase-negative staphylococci is required.     

应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌

目的探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。方法利用PCR技术扩增待检菌株的16SrRNA基因序列,通过分析待检菌株的16SrRNA基因序列对其进行鉴定。结果5株待检菌株的16SrRNA基因序列均成功扩增,其中4株的16SrRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99．9％以上,将其鉴定到种的水平,1株的16SrRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97．09％,将其鉴定为雷弗森菌属。结论应用16SrRNA基因序列分析可快速、准确地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。     

4株脑膜炎球菌菌株的16S rRNA、PorA和PorB基因序列分析

目的  对A、C、Y和W135 4个不同血清群脑膜炎球菌菌株的16S rRNA、PorA和PorB基因进行序列分析,从分子水平对其做出鉴定。方法  提取脑膜炎球菌基因组DNA为 模板,设计特异性引物进行16S rRNA、PorA和PorB基因的PCR扩增并测序。结果  A、C、Y和W135群4个菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中奈瑟菌属的脑膜炎球菌的同源性最高。4个菌株的PorA基因分型分别为P1.5-2,10; P1.7-1,1; P1.5-1,2-2; P1.5,2。PorB基因分别与porB3-26、porB2-40、porB3-100和porB3-25同源。结论  从基因水平分析表明4个菌株属于脑膜炎球菌,并在PorA和PorB基因分型上有差异。     

南京地区不同人群呼吸道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及五种耐药基因分析

目的探讨南京地区成年健康人群鼻咽部携带的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和医院下呼吸道感染患者痰液中分离的MRSA的耐药性及耐药基因分布特点。方法收集南京地区成年健康人群(健康组)鼻咽部分离的19株MRSA和医院下呼吸道感染患者(临床组)痰液中分离的51株MRSA,K-B法测定其药敏情况,多重PCR法检测mecA基因,氨基糖苷修饰酶基因aacA-aphD,大环内酯类23srRNA甲基化酶基因ermA、ermC,四环素类核糖体保护蛋白基因tetM、tetK。结果所有菌株对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺敏感,对多种抗生素的耐药率在90%以上,携带mecA基因;aacA-aphD、ermA、ermC、tetM、tetK五种耐药基因的MRSA菌株在健康组和临床组的检出率分别为94.8%、100.0%、21.0%、100.0%、10.5%和98.0%、96.1%、19.6%、96.1%、23.5%。结论南京地区成年健康人群鼻咽部携带的MRSA和医院下呼吸道感染患者分离的MRSA均表现出多重耐药,相关耐药基因检出率高。     

耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA及parC基因突变研究

目的　研究临床分离的耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA及parC基因突变情况。方法　测定临床分离的 5 5株铜绿假单胞菌MIC值 ,从中筛选出 1株敏感菌和 8株耐药菌 ,以标准敏感菌株ATCC2 785 3作为质控菌株。用聚合酶链反应 (PCR)扩增gyrA及parC基因的喹诺酮耐药决定区 (QR DR) ,扩增产物片段长度分别为 35 1bp、397bp。用限制性内切酶SacⅡ消化gyrAPCR产物 ,同时对上述 10株菌的gyrA及parC基因的喹诺酮决定区 (QRDR)进行PCR DNA直接测序分析。结果　有 8株耐菌株的gyrA基因在 83位 (ACC→ATC)有突变 ,导致氨基酸Thr→Ile的改变 ;有 3株高度耐药菌gyrA基因同时在 87位 (GAC→GGC)有突变 ,导致氨基酸Asp→Gly的改变 ;有 4株耐药菌株的parC基因在 87位有TCG→TTG突变 ,导致氨基酸由Ser→Leu的改变。同时具gy rA和parC突变MIC值是仅具gyrA突变菌株MIC值的 2～ 16倍。未发现parC突变单独存在。另外 ,有 6株耐药菌gyrA的 132位有CAC→CAT的突变 ;所有耐药菌株parC基因 115位有GCT→GCG的突变 ,该突变未引起氨基酸的改变。结论　gyrA83、87位突变及parC基因 87位突变都可引起铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物产生耐药 ,但以gyrA基因 83位突变为主 ,合并gyrA基因 87位及parC基因 87位突变可增加耐药程度。     

41株金黄色葡萄球菌耐药性分析及PVL基因检测

目的了解临床分离金葡菌对常用抗生素的耐药性和杀白细胞毒素(PVL)基因携带情况。方法采用头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),K-B法检测临床分离的41株金葡菌对常用抗生素的敏感性,PCR法检测mecA基因和PVL基因携带情况。结果 41株金葡菌中MRSA占51.2%,MRSA对克林霉素、红霉素、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),MRSA和MSSA对复方新诺明敏感率分别为90.5%和95%,未发现对万古霉素、替考拉林和利奈唑胺耐药株。21株MRSA mecA基因均阳性,41株金葡菌中共检出2株携带PVL基因,MRSA与MSSA各占1株,均分离自骨科病房。结论该院临床分离MRSA耐药率高,应规范临床用药,加强MRSA耐药性监测,加强PVL基因的检测,防止此类菌株的播散。     

New antimicrobial drug resistance and epidemiological typing patterns of <Emphasis Type="Italic">Staphylococci</Emphasis> from clinical isolates and raw meats

The antimicrobial susceptibilities of Staphylococcus isolated from clinical isolates and raw meats were tested for six different antimicrobial agents that are in widespread clinical use in Korea and four new antimicrobials, linezolid, quinupristin/dalfopristin, daptomycin, and tigecycline. And this study analyzed the mecA genes and genetic patterns of MRSA by performing epidemiological studies using the PCR method. 46%, 51%, and 79% of clinical isolates were identified as MRSA in 1998, 1999, and 2005, respectively, and the mecA gene was detected in 82% of these isolates. Of the 133 staphylococci isolated from raw meats, 18% of the isolates were found to be resistant to methicillin, but none of these isolates showed the presence of the mecA gene. New antimicrobials, which have rarely or not yet been used in Korean hospitals, showed high activity against all staphylococcal isolates including methicillin-resistant isolates. The randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) patterns of MRSA isolates differed significantly between clinical isolates and raw meat isolates.