地塞米松诱导联合骨形成蛋白2基因修饰兔骨髓间质干细胞的成骨转化

背景:骨髓间质干细胞在地塞米松等骨诱导剂的作用下能够向成骨细胞分化;同时骨形成蛋白2在骨修复过程中促进细胞增殖分化和基质分泌,在体内外均可诱导骨形成,以上二者联合应用可能会产生一定的协同效应.目的:分析体外经地塞米松诱导是否能增强骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞的成骨转化能力.设计:随机化配对设计.单位:解放军第四军医大学西京医院.材料:实验于2004-02/2004-08在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所完成.选用2月龄新西兰白兔20只,由解放军第四军医大学实验动物中心提供(许可证号:军动管字第2005C00117号).室温、常湿,正常喂食.双侧取材,左侧肢体来源骨髓间质干细胞为地塞米松诱导组,右侧为对照组(未经诱导).方法:将地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞分别转导含有人骨形成蛋白2基因的复制缺陷重组腺病毒Ad-BMP-2后,以反转录-聚合酶链反应和免疫组化方法检测细胞中骨形成蛋白2的表达情况.观察骨髓间质干细胞的生长情况,并应用碱性磷酸酶检测试剂盒及骨钙素放免试剂盒测定Ad-BMP-2转导5 d后两组骨髓间质干细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.主要观察指标:①骨髓间质干细胞中骨形成蛋白2的表达情况.②骨髓间质干细胞的形态学变化.③骨髓间质干细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.结果:①转导后骨形成蛋白2基因在地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞中均有表达.②骨髓间质干细胞经地塞米松成骨诱导后形态较不规则,呈三角形、多角形改变,较基础培养基培养细胞生长缓慢.基因转导后细胞形态无明显改变.③转基因5 d后,地塞米松诱导组骨髓间质干细胞培养上清中碱性磷酸酶活性高于对照组[(134.36±8.84,104.02±7.83) nkat/L(t =3.350 6,P＜0.01,n =20)];地塞米松诱导组骨髓间质干细胞骨钙素分泌量高于对照组[(14.68±0.73,6.52±1.21) μg/L(t =3.568 2,P＜0.01,n =20)].结论:转基因前的地塞米松诱导能够促进骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞增殖和成骨转化.     

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。方法:将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组:分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组:以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。结果与结论:转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P<0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P<0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P<0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P<0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P<0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

脂肪干细胞经低浓度骨形成蛋白2或骨形成蛋白7短期诱导后软骨及骨基因的表达

目的:探讨脂肪干细胞经低浓度骨形成蛋白2、骨形成蛋白7短期诱导后向软骨细胞和骨细胞方向的分化情况.方法:无菌切取成年新两兰大白兔皮下脂肪,胶原酶消化法体外分离培养脂肪干细胞,分为3组:骨形成蛋白2组加入含0.1 g/L维牛素C、10mmol/L β-甘油磷酸钠、10 μg/L骨形成蛋白2的诱导培养基培育15 min,然后按18×104个细胞/孔接种,再培育4～14d;骨形成蛋白7组培养方法基本相同,仅将骨形成蛋白2更换为骨形成蛋白7;对照组同法加入单纯培养基进行培育.结果:与对照组比较,骨形成蛋白2组、骨形成蛋白7组可上调脂肪干细胞数达1.78～1.79倍,上调蛋白含量达1.15～1.95倍,上调碱件磷酸酶活性达32～40倍.与对照组比较,诱导15 min培育4 d时,骨形成蛋白2组runx-2基冈表达提高1.9倍,骨桥素基因表达提商2.2倍,双聚糖基凶表达提高1.3～1.7倍;骨形成蛋白7组仅双聚糖基因表达提高1.3～1.7倍,不影响runx-2、骨桥素基因的表达.与对照组比较,诱导15 min培育14 d时,骨形成蛋白2组runx-2、骨桥素、双聚糖及aggrecan基因表达无变化:骨形成蛋白7组runx-2基因表达下调1.8倍,骨桥素基因表达下调5.0倍,双聚糖基因表达下调1.7倍,aggrecan基因表达有所提高.结论:经短期诱导后,再培养4 d骨形成蛋白2刺激runx-2和成骨基因的表达,14 d时骨形成蛋白7下调这些基因的表达,却上调蛋白多糖聚合体基因的表达.     

合成成骨生长肽对人骨髓间充质干细胞成骨转化的促进

背景:成骨生长肽在体内外细胞培养中具有明显的促成骨活性,这种促成骨作用的分子机制还不清楚,现已通过人工方法成功制备了合成成骨生长肽.目的:探讨合成成骨生长肽对体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用.设计、时间及地点:基因和蛋白水平的细胞学体外观察,于2006-07/2007-12在福建省医学科学研究所基因工程实验室及复旦大学附属中山医院中心实验室完成.材料:骨髓标本来源于福建省立医院骨一科收治的男性髂骨植骨患者,合成成骨生长肽由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所崔大敖教授惠赠,ERK1/2抑制剂UO126为美国CST公司产品.方法:密度梯度离心法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,单纯矿化液组加入由10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸组成的矿化液;10-7,10-9,1011 mol/L合成成骨生长肽组分别加入对应浓度的合成成骨生长肽,再加入矿化液;常规培养组加入含体积分数为0.1胎生血清的低糖DMEM.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR法和免疫组织化学染色检测成骨标志物的表达,Westem-blot法分析合成成骨生长肽对ERK1/2信号通路的影响,观察UO126对合成成骨生长肽作用的干预.结果:加入合成成骨生长肽后,骨髓间充质干细胞体积增大,突起增多,呈多角形,胞浆含有较多颗粒状物质,出现致密细胞结节.合成成骨生长肽在mRNA和蛋白水平均能促进成骨标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原,骨钙素的表达,定量分析结果显示10-9mol/L合成成骨生长肽促成骨作用最强.加入合成成骨生长肽后能够引起ERK1/2信号通路的持续性激活,经UO126预处理后几乎完全阻断了合成成骨生长肽对骨髓间充质干细胞的促成骨作用.结论:合成成骨生长肽可明显促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向的转化,在10-9 mol/L浓度下促成骨能力最强,其促成骨作用可能是通过激活MAPK家族ERK1/2途径实现的.     

骨髓间充质干细胞成骨过程的诱导因素和信号转导调控

背景:骨髓间充质干细胞在适宜的培养条件下可被诱导分化成各种组织细胞,此外还具有基质细胞的特性,能够分泌各种细胞因子,支持造血功能,是组织重塑和功能修复的理想细胞来源.目的:对影响骨髓间充质干细胞成骨过程的各种因素和涉及的常见信号转导通路进综述.方法:应用计算机检索Pubmed数据库(1998-01/2009-05),以"bone mesenchymal stem cell,osteogenesis"为检索词;应用计算机检索维普数据库(1998-01/2009-05),以"成骨、骨形成蛋白、骨髓间充质干细胞"为检索词.结果与结论:共收集108篇关于骨髓间充质干细胞和骨形成蛋白的文献,中文31篇,英文77篇.排除发表时间较早、实验设计科学性较差的文献,共15篇文献符合标准被纳入.骨髓间充质干细胞其成骨过程在很大程度上取决于诱导分化条件,基本辅剂、骨形成蛋白及其他一些细胞因子和激素均在此列,此外多条信号转导通路办参与调控骨髓间充质干细胞成骨过程.热休克蛋白在骨髓间充质干细胞增殖、分化、成组织过程及应对外界刺激的保护效应的信号通路调控机制值得关注.     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔下颌骨牵张成骨实验的组织形态学观察

背景:如何提高牵张成骨过程中新骨形成的速度和质量,缩短牵张成骨治疗时间,减少并发症的发生是目前该领域的研究热点。目的:观察人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。方法:36只新西兰白兔随机摸球法分为3组。建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射人骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞;对照组注射等量自体骨髓间充质干细胞;空白组注射等量生理盐水。结果与结论:在固定期2周及6周实验组牵张区骨小梁形成质量明显好于对照组和空白组。证实骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

骨形成蛋白-7对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

目的探讨骨形成蛋白-7(BMP-7)对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响。方法晚期糖基化终产物诱导发生上皮-间叶转化的体外培养大鼠腹膜间皮细胞,分别经含5 ng/mL及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基和含10 ng/mL BMP-7及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基培养48 h,以含80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基为对照,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果 BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGFmRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 BMP-7能上调上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin表达和下调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达,BMP-7能逆转晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

腐胺促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的:探索腐胺对人骨髓间充质干细胞(MSC)增殖分化的影响,以期建立一种新的MSC成骨分化诱导体系。方法:采集3份健康人骨髓MSC,应用MTT实验检测腐胺对细胞增殖的影响。实验分为:1腐胺组(100μmol/L腐胺),2阳性对照组(加入以地塞米松、抗坏酸磷酸盐和β-磷酸甘油组成的标准诱导体系),3阴性对照组(未加腐胺体系),MSC培养1周后应用PCR法检测细胞Runx-2表达水平,2周后进行碱性磷酸酶原位组织化学染色,并将部分细胞裂解后测定细胞碱性磷酸酶活性及蛋白质浓度。此外,以标准成脂分化诱导体系为阳性对照,MSC培养体系中加入腐胺,培养2周后油红O染色,观察腐胺诱导MSC成脂细胞分化作用。结果:在一定范围内腐胺促进人骨髓MSC增殖,且效应呈浓度依赖性。腐胺(100μmol/L)培养MSC 1周后,细胞Runx-2表达水平显著增加;2周后,组织化学染色显示,细胞呈现明显的碱性磷酸酶活性,单位细胞蛋白质浓度内酶活性显著高于阴性对照组(0.87±0.012 vs 0.52±0.010)(P0.01),也明显高于阳性对照组(0.83±0.029)(P=0.02)。在该浓度下,油红O染色显示腐胺组MSC未发生脂肪细胞分化。结论:腐胺可促进MSC增殖并促使其向成骨细胞分化,可作为MSC体外成骨细胞分化新诱导成分之一。     

AdCMV-BMP-7促进兔骨髓基质细胞的成骨分化

目的:研究表明骨形态发生蛋白7可促进软骨的再生和重建.实验拟证实人骨形态发生蛋白7可促进兔骨髓基质细胞分化为成骨细胞.方法:实验于2005-10/2006--03在解放军第二军医大学长征医院完成.①实验材料:pAdTrack-CMV,pAdEasy-1 及pGEM-T-BMP-7质粒均由许国华博士惠赠;大肠杆菌TG1、DH5a、BJ5183及包装细胞株293为本实验室保存:成年雄性新西兰大白兔2只购于解放军第二军医大学动物中心.②实验过程及评估:构建重组腺病毒表达载体AdCMV-BMP-7:首先将骨形态发生蛋白7序列插入到穿梭载体pAdTrack中,得到重组腺病毒pAdCMV-BMP-7;传代培养至第3代兔骨髓基质细胞,加入不同滴度值的AdCMV-BMP-7培养7 d,以感染腺病毒空载体和未感染AdCMV-BMP-7的兔骨髓基质细胞作为阴性对照,观察碱性磷酸酶含量与时间及剂量的关系.结果:①重组AdCMV-BMP-7的构建:采用的AdEasyTM-1载体系统含有报告基因绿色荧光蛋白,筛选时间大为缩短,得到大约34 kb大小的AdCMV-BMP-7.②AdCMV-BMP-7促进兔骨髓基质细胞分化结果:感染AdCMV-BMP-7后的骨髓基质细胞合成碱性磷酸酶明显增加且旱时间及剂量依赖性,而骨髓基质细胞感染腺病毒空载体对碱性磷酸酶合成无影响,提示骨髓基质细胞在单一的骨形态发生蛋白7作用下即可分化为成骨细胞.结论:实验结果提示重组腺病毒表达载体AdCMV-BMP-7能够促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且成时间依赖性及剂量依赖性.     

腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因在兔脂肪干细胞的表达与成骨分化效应

目的:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染兔脂肪干细胞,观察目的基因在脂肪干细胞中的表达效率及向成骨细胞定向分化的能力。方法:实验于2005-12/2006-09在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室进行。①实验材料:4月龄健康新西兰大耳白兔2只。质粒pAd-BMP-2由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士惠赠;携带β-半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体由李康博士惠赠;大肠杆菌DH5a以及293细胞由本实验室保存。②实验方法:新西兰兔肌注麻醉后,完整取出双侧腹股沟脂肪垫,清除外包膜、明显的结缔组织和小血管,剪碎,离心,体外分离培养脂肪干细胞。表达载体pAd-hBMP-2经293细胞包装重组腺病毒后,取第3代生长良好的脂肪干细胞,按5×105接种于60mm培养皿,将Ad-hBMP-2病毒以感染复数10～20感染细胞。将成功转染骨形态发生蛋白2的脂肪干细胞作为转染组,以转染携带β-半乳糖酐酶基因腺病毒载体的脂肪干细胞作为对照组。两组均置入不含骨形态发生蛋白2的无血清成骨诱导培养基中进行诱导分化。③实验评估:定期观察细胞的形态学变化,MTT法绘制生长曲线,计算增殖时间;成骨诱导培养后测定碱性磷酸酶活性,光倒置显微镜下观察钙化结节形成情况;RT-PCR、免疫组织化学法、Westernblot法检测目的基因人骨形态发生蛋白2和成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的表达。结果:①脂肪干细胞转染前后形态学变化、生长曲线及倍增时间:Ad-hBMP-2基因修饰的脂肪干细胞经诱导培养后形态规则,多角型细胞增多,转染组的细胞生长曲线倍增时间明显短于对照组。②碱性磷酸酶活性及矿化结节形成:转染组脂肪干细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,成骨诱导培养7,10,14d均显著高于未转染组(P<0.01)。转染组成骨细胞四环素标记显示圆形矿化结节呈金黄色,数量多,结节大。③脂肪干细胞人骨形态发生蛋白2与Ⅰ型胶原、骨钙素的表达:成骨诱导培养7,14d,RT-PCR、免疫组织化学法、Western blot法检测结果显示转染组目的基因人骨形态发生蛋白2、成骨标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的分泌表达均明显强于对照组。结论:经Ad-hBMP-2基因修饰的兔脂肪干细胞在体外能定向分化为成骨细胞,且分化增殖能力强;目的基因骨形态发生蛋白2表达高、持续时间长。     

糖皮质激素促间充质干细胞的成骨效应

背景：糖皮质激素是有效的免疫抑制和抗炎症药物而广泛应用于临床,然而长期服用后也会引起一些不良反应如骨质疏松症。糖皮质激素通过促进成骨细胞与骨细胞的凋亡,同时抑制间充质干细胞向成骨细胞分化,导致成骨细胞数量减少;然而在一定的条件下,糖皮质激素又能够促进间充质干细胞表达成骨细胞标志基因诱导其向成骨方向分化。目的：对以地塞米松为代表的糖皮质激素在间充质干细胞成骨分化中发挥的作用以及可能的分子机制进行综述。方法：由第一作者检索PubMed数据库1978至2012年有关地塞米松和间充质干细胞成骨分化的文献,英文关键词“Mesenchymal stem cell, dexamethasone, osteogenesis, osteoporosis, Runx2, BMP,Noggin, GILZ, glucocorticoid receptor”以不同的组合方式查找,排除重复性的研究,最终保留55篇进行归纳综述。结果与结论：地塞米松能够调节Runx2,Noggin以及亮氨酸拉链蛋白等基因调控间充质干细胞成骨分化。当糖皮质激素作用于间充质干细胞时,可能由糖皮质激素受体介导其生理作用,也可能在糖皮质激素与其受体结合之前就受到11β-羟甾类脱氢酶的调节。另外,生理剂量（10^-88mol／L）的地塞米松能促进问充质干细胞成骨分化,药理剂量（≥10^-7mol／L）有抑制作用。     

转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化

背景:国内外许多学者成功利用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化报道较多,而对骨形态发生蛋白2作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的报道较少.目的:观察验证转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞下向软骨细胞表型转化的可能性及相互作用.方法:取健康Wistar大鼠骨髓,采用贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞.按添加生长因子的不同分为4组:转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2组,转化生长因子β1组,骨形态发生蛋白2组,对照组不添加任何生长因子.于诱导14 d后,分别进行阿利新蓝染色和二甲基亚甲蓝比色法定性定量检测糖胺聚糖的分泌表达,免疫组织化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:3个加入细胞因子的实验组在阿利新蓝染色和软骨特异性Ⅱ型胶原疫组化法检测中均有不同程度的阳性表达,糖胺聚糖的定量检测中,转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2联合应用组的糖胺聚糖含量明显高于其他组(P<0.05).结果提示转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化,分泌软骨特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源.     

阳离子脂质体介导rhBMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞体外分化成骨活性的实验

目的:探讨阳离子脂质体介导的重组人骨形态发生蛋白(Adv-rhBMP-2)基因对兔骨髓基质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MMSCs)体外成骨活性的影响。方法:2002-05/07在解放军总医院骨科研究所完成。脂质体介导的基因转染和检测方法:pEGFP-rhBMP-2的扩增、浓度及纯度鉴定。①脂质体包裹质粒DNA,转染MMSCs后测定转染率。②检测rhBMP-2,碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原的表达。结果:脂质体介导的基因转染后的检测结果:①脂质体介导pEGFP-rhBMP-2转染MMSCs后所测定的最大转染率为14.18%。②pEGFP-rhBMP-2转染的MMSCs中rhBMP-2,ALP和Ⅰ型胶原的表达呈阳性,而pEGFP转染的细胞和未染细胞rhBMP-2,ALP和Ⅰ型胶原的表达弱阳性。结论:①MMSCs是一种较理想的骨组织工程种子细胞。②脂质体介导质粒rhBMP-2的基因转移安全性好,但转染率相对较低,随着新一代高转染率脂质体的问世,这种治疗方法有望率先进入临床。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞过程中端粒酶的表达

背景:端粒酶在细胞分化及活化过程起重要作用。目的:检测骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞过程中端粒酶的表达。方法:采用PCR-ELISA端粒酶检测方法检测SD大鼠骨髓间充质干细胞传代培养前6代细胞中端粒酶的表达;将传代培养的第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞,传代培养至第6代,检测各代细胞中端粒酶的表达。以人胚肾细胞系293细胞蛋白提取物作为阳性对照,以灭活细胞蛋白提取物为阴性对照。结果与结论:端粒酶在传代培养的前6代骨髓间充质干细胞中呈阳性表达,为阳性对照组的9.4%～30.9%,第3代表达最高;在诱导分化为神经干细胞传代培养的前5代呈阳性表达,为阳性对照组的5.4%～33.1%,第3代和第4代表达最高。说明端粒酶是细胞分化、增殖的一个重要因素。     

重组Osf2定向调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的研究成骨细胞特异性因子(Osf2)调控骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为成骨细胞(OB)的分子机制。方法用Percoll密度梯度离心法分离获得大鼠的MSCs,通过细胞免疫化学、免疫荧光、透射电镜及流式细胞仪等方法进行鉴定。构建真核表达载体pcDNA3.1( )/Osf2,通过脂质体系统转染传代培养后的MSCs,用Northern Blot检测三种OB细胞外基质蛋白mRNA的表达情况。结果转染后的MSCs都表达OB特异性基质蛋白骨钙素、骨桥接蛋白和I型胶原。结论Osf2在转录水平定向调控MSCs分化为成骨细胞,可应用于骨质疏松、骨缺损等疾患的基因治疗。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。