大肠杆菌O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体的构建

目的：构建EHEC O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体。方法：根据已知的O157∶H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,最后通过PCR和测序手段证实。结果：获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7 EDL933w突变菌株。结论：为进一步研究O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7Ⅲ型分泌系统的缺陷突变株对HeLa细胞黏附能力的影响

目的：构建O157∶H7 EDL933菌株Ⅲ型分泌系统（ T3SS）缺陷突变株ΔescR,感染HeLa细胞后检测其黏附能力。方法通过重叠延伸PCR扩增出中间为卡那霉素抗性基因,两侧为escR基因上下游同源序列的重组线性DNA片段,电击转入含pKD46的EDL933感受态细胞中,escR基因被kan基因替换而缺失。绘制野生株与ΔescR生长曲线,并利用免疫荧光观察两株细菌对HeLa细胞的黏附能力。结果获得缺陷突变株ΔescR,相较于野生株,该突变株在DMEM（10％FBS）培养基中生长速度以及对HeLa细胞的黏附能力明显下降。结论 T3SS结构蛋白escR基因的缺失破坏了EDL933 T3SS的形成,影响了该菌株黏附能力,其构建为后续研究T3SS奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

阿莫西林克拉维酸钾颗粒(8∶1)治疗呼吸系统细菌感染多中心随机对照研究

目的:评价注射用阿莫西林克拉维酸钾颗粒(8∶1)治疗急性呼吸道感染的有效性和安全性。方法:采用多中心、随机、双盲、平行对照试验设计,共入选病例136例,其中试验组[阿莫西林克拉维酸钾颗粒(8∶1)]69例;对照组[阿莫西林克拉维酸钾片(7∶1)]69例;一般疗程均为7～14 d,最短疗程不少于5 d。结果:试验组治疗有效病例69例,治愈59例,临床痊愈率为89.39%;对照组治疗有效病例69例,治愈61例,临床治愈率为92.42%。细菌清除率:试验组为95.45%,对照组为92.91%,药物不良反应发生率均为4.35%。结论:阿莫西林克拉维酸钾颗粒(8∶1)治疗各种敏感菌所引起的呼吸道感染,安全、有效,使用方便,耐受性好。     

基于荧光碳点的免疫荧光探针构建及其对大肠杆菌的特异性识别

目的：将碳点（ CDs）应用在免疫荧光探针成为取代传统荧光染料的新型标记物。方法通过微波加热方法制备高强荧光碳点,并通过EDC偶联法与大肠杆菌抗体结合形成复合免疫荧光探针,以大肠杆菌O157∶H7为检测模型进行特异性识别实验。结果碳点成功应用在免疫标记大肠杆菌O157∶H7,并可见多色荧光。结论免疫荧光探针成功地识别大肠杆菌O157∶H7,表明碳点可作为免疫荧光探针的荧光标记物,有望制成具有自主知识产权的新型低毒生物传感器。     

新一代H_1受体阻滞剂对心血管系统的影响

早在30年代,Bovet等即发现了组胺H_1受体阻滞剂,至今仍用于治疗过敏性及变态反应性疾病。为减低其对中枢神经系统的作用,晚近研制了新一代H_1受体阻滞剂,临床应用日趋广泛。发现的新副作用,尤其是对心血管系统的毒性反应,报道日渐增多。现予综述如下。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对人肺鳞癌H157细胞增殖的影响

目的：观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺鳞癌H157细胞增殖的影响。方法：将H157细胞分为对照组和AMOs处理组，AMOs处理组采用AMOs抑制H157细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[^3H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果：与对照组相比，AMOs显著减少H157细胞[^3H]-TdR掺入量（P〈0．01），随着浓度从10nmol／L逐渐增加至于100nmol／L，H157细胞[^3H]-TdR掺入量亦随之减少（P〈0．01）；AMOs显著抑制H157细胞的增殖（P〈0.01），使G0／G1细胞比例显著增加，G2／M期细胞比例显著减少（P〈0．01）。结论：AMOs通过抑制H157细胞内高水平表达miR-155的活性，显著抑制H157细胞的增殖。     

Nd∶YAG激光后发性白内障切开技术的探讨

为探讨Ｎｄ∶ＹＡＧ激光治疗后发性白内障的技术问题，回顾了３４例３５只眼Ｎｄ∶ＹＡＧ激光治疗后发性白内障的类型、击发能量与脉冲、切开方法和术后效果。从Ｎｄ∶ＹＡＧ激光的聚焦、能量和切开方法的选择、病人视轴区的确定与术后并发症的观察处理方面，探讨了Ｎｄ∶ＹＡＧ激光后发性白内障的切开技术问题。结果表明，Ｎｄ∶ＹＡＧ激光治疗后发性白内障安全有效。为了避免损伤焦点周围的光学界面组织，必须有足够的功率密度和准确的聚焦，从最小能量开始，逐渐增加，直到出现切割效果。由于后发性白内障厚薄、机化程度以及有无人工晶体、虹膜粘连、后囊破裂、玻璃体脱出和偏位激光孔等不同情况，手术时选用适当的切开方法也十分重要。     

Er,Cr∶YSGG激光预备牙本质对充填材料粘结力影响的研究

目的探讨Er,Cr∶YSGG激光预备牙本质对充填材料粘结力的影响。方法20颗完整无龋坏、无充填的离体正畸前磨牙,随机分成A（15颗）、B（5颗）两组。A组试验侧（颊侧）、对照侧（舌侧）分别用Er,Cr∶YSGG激光和传统牙钻处理牙本质表面,FujiⅨ充填,经500次冷热循环后,检测牙本质与充填材料之间抗剪切粘结强度,体视显微镜下观察粘结断面;B组试验侧（颊侧）、对照侧（舌侧）分别用Er,Cr∶YSGG激光和传统牙钻预备3 mm×3 mm的窝洞、洞深位于釉牙本质界下0.5 mm,经FujiⅨ充填,冷热循环后,扫描电镜下观察粘结界面的情况。结果A组试验侧和对照侧的抗剪切粘结强度分别为（3.79±0.38）MPa和（3.17±0.19）MPa,差异有显著意义（P〈0.05）。为体视显微镜观察显示粘结断面充填物残余试验侧多于对照侧。B组试验侧牙体组织与充填材料间缝隙比对照侧小。结论用Er,Cr∶YSGG激光预备牙本质能增加充填物与牙体组织的粘结力。     

Nd∶YAG激光光纤插入照射兔鼻甲的显微结构研究

为了研究激光治疗肥厚性鼻炎的机理，我们用Ｎｄ∶ＹＡＧ激光光纤插入照射或外凝家兔鼻甲，其输出功率密度为１５２９，３３１２和４４５９Ｗ／ｃｍ２。根据病理改变，得出三个结论：（１）最佳治疗功率密度是３３１２Ｗ／ｃｍ２。如果功率密度小于３３１２Ｗ／ｃｍ２，则疗效较差。如果大于３３１２Ｗ／ｃｍ２，则易继发萎缩性鼻炎。（２）当用Ｎｄ∶ＹＡＧ激光光纤插入照射或外凝兔鼻甲时，粘膜下血管发生狭窄或闭塞，这为临床提供了病理基础，探明了治疗的原因。（３）根据兔鼻甲的病理改变证明Ｎｄ∶ＹＡＧ激光光纤插入照射对粘膜的损伤明显小于外凝法，故插入法能保存鼻腔的正常生理功能，明显优于外凝法。     

双岐杆菌对小鼠H_(22)腹水瘤治疗作用的探讨

目的 探讨双岐杆菌对小鼠H_(22)腹水瘤的治疗作用,以寻找治疗肿瘤新的生物制剂。方法 将H_(22)腹水瘤细胞接种小鼠腹腔后分成对照组、死菌组与活菌组,每组10只,分别用生理盐水、死菌与活菌治疗。结果 对照组平均存活14.5天,死菌组平均存活16.6天,生命延长率14,5％,活菌组平均存活20.8天,生命延长率43.4％,相差非常显著(P<0.01)。结论 双岐杆菌对小鼠H_(22)腹水瘤有治疗作用,可延长小鼠生存时间。     

用Red系统敲除大肠杆菌O157:H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157:H7的突变体.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5'端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除.结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7突变菌株.结论:为进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

NDV对小鼠H_(22)腹水瘤治疗作用的探讨

肿瘤逃避机体免疫排斥的机制之一,是肿瘤细胞存在的肿瘤相关抗原的免疫原性较弱,不足以引起宿主有效的抗肿瘤免疫反应。NDV可以改变或影响瘤细胞的免疫原性,诱发和促进机体对肿瘤的排斥反应。本文探讨了新城疫病毒(new castle disease virus,NDV)对小鼠H_(22)腹水瘤的治疗作用。对照组接种H_(22)瘤细胞后第8d死亡1只,至第16d10只小鼠全部死亡,存活率为0％,平均存活14.1d。实验组注射瘤细胞后第12d死亡2只,至23d死亡9只,1只无瘤存活,存活率为10％。死亡鼠平均存活天数为18d,比对照组延长3.9d,两组相差显著(P<0.05)。实验结果表明NDV对小鼠H_(22)腹水瘤有治疗作用,能抑制小鼠H_(22)腹水瘤的生长,可延长小鼠生存时间。NDV可作治疗肿瘤的一种新生物制剂。     

内镜Nd∶YAG激光治疗食管和贲门早期癌的临床体会

为研究Ｎｄ∶ＹＡＧ激光治疗早期食管、贲门癌的疗效。我们观察了９例不适宜手术、３４例拒绝手术而同意接受内镜Ｎｄ∶ＹＡＧ激光治疗的疗效。采用的激光治疗仪有输出功率为７０Ｗ、脉冲时间１ｓ、光距０．５～１．０ｃｍ与输出功率３０Ｗ的二台Ｎｄ∶ＹＡＧ激光器。治疗以准接触连续扫描照射方式经１～６次（平均２．６次）激光照射，４２例（占９７．７％）癌细胞消失，无穿孔等并发症。４２例随访１０～５５个月，其中６例于治愈后３６～４０个月复查时，发现早期癌灶，经内镜激光补充治疗，癌细胞消失。其余无癌复发。     

用大肠杆菌制备O157多糖-菌毛蛋白结合物的研究

目的以大肠杆菌O157型多糖与菌毛蛋白PilE为模型,在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗技术提供基础。方法用Red重组技术敲除大肠杆菌W3110的O抗原连接酶基因waaL,构建CLM24菌株。在该菌株中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE、寡糖转移酶基因pglL,构建O-糖基化修饰系统。分别转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL与大肠杆菌O157型多糖表达载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,再利用Western印迹检测菌毛蛋白PilE的修饰情况。结果利用抗His-tag单抗进行Western印迹检测,16℃IPTG诱导条件下,转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL与其他对照菌相比,不仅在相对分子质量为19×103处有特异性条带,而且在相对分子质量（40～60）×103处也出现了特异的梯状条带;转化大肠杆菌O157的O多糖基因簇克隆载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EHpilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157用抗O157多抗和抗His-tag单抗进行Western印迹检测,在相对分子质量（40～60）×103处均产生特异的梯状条带。结论在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得多糖-蛋白结合物。本研究为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供了技术基础。     

NDV/MC联合治疗小鼠H_(22)腹水瘤的实验研究

目的:探讨NDV/MC联合治疗小鼠H_(22)腹水瘤的协同增效作用,以提高对肿瘤的治疗效果。方法:将H_(22)瘤细胞接种小鼠腹腔后分成Hanks液、NDV、MC、NDV与MC组,每组给8只;分别用Hanks液、NDV、MC、NSV与MC联合治疗。结果:Hanks液组平均存活14.8d,存活率0.0％;NDV组存活19.6d,存活率12.5％;MC组存活18.8d,存活率25.0％;NDV与MC联合治疗组存活24.4d,存活率37.5％。结论:NDV与MC联合治疗小鼠H_(22)腹水瘤,疗效显著高于单纯NDV与单纯MC组,抗肿瘤效果有显著差异。