幽门螺杆菌vacA基因PCR-RFLP分型

目的为幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,简称Hp)的基因分型提供一种可选择的指标,并通过分型与空泡毒素(vacuolatingcytotoxingeneAproduct,VacA)表达情况分析HpvacA基因的多态性。方法用自行设计的引物对18株Hp的vacA基因进行扩增,用7种限制性内切酶对基因扩增产物进行限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)分析;通过细胞测毒法对18株HpVacA活性进行检测。结果18株Hp的vacA扩增产物为2.75kb左右,但长度有差异;只有HeaⅢ可将vacA基因切出整齐的谱型,18株Hp被分为12种谱型。未发现VacA表达相关的谱型。结论HpvacA基因具有一定的多态性,而vacA基因的PCR产物经HeaⅢ酶切的RFLP分型可作为Hp基因分型的较理想选择指标。为Hp分子流行病学调查提供一种有效方法。     

应用巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异-rtN236T变异

目的 建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒（HBV）阿德福韦（ADV）耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法。方法 根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物，使野生株（rt236N）PCR产物中含有DraⅠ酶切位点（5’TITAAA3’），而变异株（rt236T）无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清，经PCR扩增、DraⅠ酶切、3％琼脂糖凝胶电泳，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBV RT区基因序列分析。结果 自4份血清标本中检测到1例rtN236T变异。所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高，可以检测到10^3copies／L的HBV DNA；特异性强，其RFLP分析结果与DNA测序结果一致。结论 应用ntPCR-RFLP方法检测rtN236T变异具有灵敏、特异、简便的优点，适用于ADV耐药变异的临床监测工作。     

杜氏利什曼原虫:PCR分析技术和DNA测序显示苏丹分离株的种内多态性

作者采用单链非特异性引物的PCR指印技术、核糖体操纵子内转录间隔区扩增产物的限制性片段长度多态性分析(ITS-RELP)、单链构象多态性(SSCP)和ITS测序等法研究26个杜氏利什曼原虫分离株间的多态性,其中23个为东部苏丹分离株,另外3个虫株分别来自肯尼亚、印度和中国。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒准种特点的初步研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）准种在慢性乙型肝炎患者中的存在状态。方法 以已知中国株HBV基因序列为依据。设计特异性聚合酶链反应（PCR）引物,自3例慢性乙型肝炎患者体内扩增HBV全S基因片段,克隆人pGEMTeasy质粒,用限制性片段长度多态性（RFLP）法确定HBV的变异现象,DNA测序确定病毒的变异程度。结果 分别自3例患者血清中克隆出29、28和8个阳性克隆,以EcoRⅠ酶切患者1和2的RFLP结果提示各有5种不同的长度带型,PCR产物XhoI酶切RFLP结果表现为高度保守,测序结果发现HBV体内毒株DNA序列高度一致,同一患者两株全S区序列测序结果表明DNA序列的同源性大于97%。结论 慢性乙型肝炎患者体内有HBV准种共存,且呈现出一定的优势克隆现象。可能与患者预后有关。     

ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtA181V变异

目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异- rtA181V变异的快速检测方法．方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株(rt181 A)PCR产物中含有Blp Ⅰ酶切位点(5’GCTNAGC3’),而变异株(rt181V)无此限制性酶切位点．选取4份应用ADV治疗1 a以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清,经PCR扩增、Blp Ⅰ酶切、30 g／L琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析．并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各一例进行 HBV RT区基因序列分析及对照质粒的构建．结果:自4份血清标本中检测到2例rtA181V变异．所建立的ntPCR—RFLP方法灵敏度高,可以检测到103 copies／L的HBV DNA;特异性强,其 RFLP分析结果与DNA测序结果一致．结论:应用ntPCR-RFLP方法检测rtA181V 变异具有灵敏、特异、简便的优点,适用于 ADV耐药变异的临床监测工作．     

载脂蛋白E基因型的检测及临床意义

目的：探讨载脂蛋白E（ApoE)基因型的检测方法及其临床意义。方法：用人工合成的寡聚核苷酸引物，通过多聚酶链反应（PCR）特异性体外扩增ApoE基因的特异性DNA片段。扩增产物用限制性内切酶Hhal消化，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行限制性片段长度多态性（RFLP）基因分型。结果：运用PCR－RFLP方法检测了53例健康人和55例冠心病患的ApoE基因型.两组对象基因型频率E3／2分别为9．4％和3．6％；E3／3为64．2％和60％；E4／3为26．4％和30．9％；E4／4为0和3．6％；等位基因频率E2分别为0．047和0．027；E3为0．820和0．773；E4为0．132和0．200，P均＞0．05，可能与样本小有关。结论：PCR－RFLP法检测ApoEAD基因型简便、准确，有很强的临床应用价值。     

拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒聚合酶基因G743C和G743A点突变的检测及分析

目的 探讨拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒聚合酶(HBVP)基因点突变。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增拉米夫定耐药患者的HBVP基因，产物经直接测序检测其YMDD变异；同时，用PCR-限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)分析测序后的17例YIDD变异样本，先用3对引物扩增HBVP基因，再分别用3个限制性内切酶FokⅠ、SspⅠ、Alw441酶切扩增产物，酶切产物用8．0％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果 拉米夫定耐药患者HBVP基因PCR产物序列分析结果与GenBank的HBV标准株相比，发现16例存在HBVP基因G743C点突变和1例存在G743A点突变。其核苷酸序列由ATG变为ATC和ATA，YMDD基因序列发生变异，即由YMDD变异为YIDD；但是，PCRRFLP不能确定这17例样本存在YIDD变异。结论拉米夫定耐药患者存在HBVP基因G743C和G743A的点突变，同样引起YIDD变异；而PCR—RFLP法不能准确地检测出G743C和G743A的点突变；该发现对HBVP基因YMDD变异检测和临床均有指导意义。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒准种特点的初步研究

探讨乙型肝炎病毒（HBV）在慢性患者中存在状态，以HBV基因序列为依据。设计特异性多聚酶链反应（PCR）引物，自2例慢性患者体内扩增HBV全S基因片段，克隆入T载体。限制片段长度多态性（RFLP）法确定HBV的变异现象，DNA测序确定病毒的变异程度，质粒EcoRI酶切RFLP结果提示自2例患者血清中克隆出的29和28个阳性克隆中各有5种不同的长度带型，PCR产物XhoI酶切RFLP结果则表现为高度保守，测序结果发现HBV体内毒株碱基序高度一致，同一患者两株全S区序列测序结果表明DNA序列的同源性大于97%。本结果提示HBV慢性患者体内有HBV准种共存，且呈现出一定的优势克隆现象。     

PCR-RFLP在细粒棘球绦虫种株鉴定中的应用

目的根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征,建立一种新的细粒棘球绦虫种株（基因型）鉴定技术。方法应用PCR-RFLP方法,对新疆不同地区44个囊型包虫病（CE）病人分离株标本提取DNA,用特异性引物对mtDNA rrnL基因片段进行PCR扩增,将扩增产物用限制性内切酶SspI和Bg1Ⅱ消化,再用琼脂糖凝胶电泳分析片段大小,进行基因型鉴别。结果CE病人分离株PCR扩增产物均不能被限制性内切酶SspI酶切,为细粒棘球绦虫;其中43个病人分离株的PCR扩增产物不能被限制性内切酶Bg1Ⅱ酶切,为细粒棘球绦虫G1基因型;1个病人分离株的PCR扩增产物被Bg1Ⅱ切成158 bp和403 bp 2条DNA片段,为细粒棘球绦虫G6基因型。结论根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于细粒棘球绦虫的基因型鉴别。     

应用ntPCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异

目的建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒（HBV）阿德福韦（ADV）耐药变异-rtN236T变异及rtA181V变异的快速检测方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物，使野生株rt236NPCR产物中含有DraⅠ酶切位点（5′-TTTAAA-3′），而变异株rt236T无此限制性酶切位点；使野生株rt181APCR产物中含有BlpⅠ酶切位点（5′-GCTNAGC-3′），而变异株rt181V无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBVDNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清，经PCR扩增、限制性内切酶酶切及凝胶电泳，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBVRT区基因序列分析。结果建立的ntPCR-RFLP方法可以检测到10^2copies／L的HBVDNA；RFLP分析结果与DNA测序结果一致，4份血清标本中检测到1份rtN236T变异，2份rtA181V变异。结论应用ntPCR-RFLP方法检测HBV阿德福韦耐药变异具有灵敏、特异、简便的优点，适用于HBV耐药变异的监测。     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

常见致病菌23S rRNA基因片段序列分析及其应用初探

目的通过临床常见致病菌23S rRNA基因序列差异的分析，探索建立可同时检测或鉴定多种细菌的分子生物学方法。方法对常见致病菌23S rRNA基因的一个多变区序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增和测序分析，根据序列差异设计相应引物和探针，并采用PCR-凝胶电泳分析和PCR-反向杂交技术检测或鉴定临床常见致病菌。结果1.革兰阳性菌和革兰阴性菌间的23S rRNA基因序列存在较大差异，通过PCR扩增和凝胶电泳分析能快速区分待测菌株为革兰阳性菌抑或革兰阴性菌。2.不同菌种间亦存在一定差异，可通过PCR-反向杂交技术将细菌鉴定到种。结论.临床常见致病菌的23S rRNA基因之间存在可供细菌鉴定的序列差异，据此可望建立各种具有快速，灵敏，准确特点的分子生物学方法，为细菌感染的快速病原诊断提供客观依据。     

Characterization of mycobacteria isolated from bovines by PRA-targetting hsp 65 gene region

Bovine tuberculosis caused by the bacterium Mycobacterium bovis is a major infectious disease of animals and has zoonotic importance for humans. Even though the incidence is believed to be very low in India, human tuberculosis caused by M. bovis has been increasingly recognized in many other countries of the world. As differentiation of mycobacterial species take long time, a method for the rapid identification of mycobacteria isolated from bovine samples to the species level was used, which is based on polymerase chain reaction (PCR) of the gene encoding for the 65-kD protein followed by restriction analysis. The method involves restriction enzyme analysis of PCR products obtained with primers common to all mycobacteria and generate M. tuberculosis complex specific pattern. PRA was performed on 33 bovine isolates of which 90.9% (30/33) isolates were identified clearly as M. tuberculosis complex, M. fortuitum, M. phlei and M. smegmatis using restriction enzyme Hae III.     

Simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus and Brucella melitensis by combinatorial PCR

ObjectiveTo evaluate simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus (B. abortus) and Brucella melitensis (B. melitensis) through the combinatorial PCR method.MethodsThis study was designed using three primers that could simultaneously identify and differentiate two major species of pathogenic Brucella in humans and animals. Identification and differentiation of each species using the size of the PCR product were determined. To determine the specificity of the method, bacteria close to the genus Brucella were used. Finally, to confirm PCR products, In addition to the products sequence, RFLP was performed on PCR products using restriction enzymes.ResultsThe method of optimized combinatorial PCR in this study could simultaneously detect and differentiate B. abortus and B. melitensis with high specificity and sensitivity in clinical samples. Differentiation of species is based on the resulting bands; therefore, the band 494 bp for B. abortus and 733 bp for B. melitensis were obtained. RFLP and sequencing results confirmed PCR results.ConclusionsThe results of this study shows that without routine diagnostic methods such as culture and serology tests, using the molecular method of combinatorial PCR, important species of Brucella can be simultaneously identified and differentiated in clinical samples.     

肺炎嗜衣原体MOMP和人IL-2融合基因DNA疫苗的免疫原性研究

目的构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(MOMP)单基因及momp和人IL-2融合基因的真核表达载体并比较其免疫反应性,为研制Cpn核酸疫苗提供理论和实验依据。方法扩增Cpn momp及人IL-2基因并将二者融合,将momp和momp-IL-2分别克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫荧光组化法检测重组质粒在小鼠组织内的稳定表达;ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体和小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果成功制备了pcDNA3.1(+)-momp和pcD-NA3.1(+)-momp-IL-2的纳米核酸疫苗;Cpn momp单基因和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体,且pcDNA3.1(+)-momp-IL-2能诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体(P<0.05);pcDNA3.1(+)-momp-IL-2诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的量及对特异抗原的刺激指数明显高于pcDNA3.1(+)-momp。结论Cpn momp单基因核酸疫苗和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答;pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的免疫效果强于pcDNA3.1(+)-momp。     

PCR法检测猪胃内的螺杆菌

目的检测猪胃内是否存在幽门螺杆菌和其它螺杆菌。方法以一对幽门螺杆菌种特异性16SrDNA引物PCR扩增检测样品中幽门螺杆菌。合成三条螺杆菌属特异性引物,扩增螺杆菌16SrDNA部分序列检测螺杆菌,并通过限制性内切酶图谱和序列分析确定种。结果检测的48份样品中,幽门螺杆菌种特异性引物扩增全部呈阴性,但有50%样品存在螺杆菌。限制性酶切图谱和序列分析表明,存在三种螺杆菌,可能为Helicobactercanadensis、Helicobacterheilmannii和Helicobacterrodentium。结论所检测的猪胃标本未发现幽门螺杆菌,可能存在Helicobactercanadensis、Helicobacterheilmannii和Helicobacterrodentium。     

日本立克次体DNA扩增产物的序列分析及其应用于蜱媒的鉴定

序列分析由日本立克次体ＤＮＡ扩增的５８９－ｂＰＣＲ产物。该扩增引物来自立氏立克次体的１９０ｋＤ蛋白的基因序列。ＰＣＲ产物含有－５３３ｂＰＤＮＡ片段，该片段可被Ｒｒｌ９０．７０ｐ和Ｒｒ１９０．６０２ｎ引物所扩增［６］。日本立克次体的这个ＤＮＡ片段的序列与立氏立克次体进行比较，发现这两种立克次体该部分ＤＮＡ的遗传同源性为９３％。序列分析确定４种内切酶用于ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴别日本立克次体，用这种技术，长角血蜱被鉴定为东方斑点热病的蜱媒。     

Polymerase chain reaction-based diagnosis of Mediterranean spotted fever in serum and tissue samples

A nested polymerase chain reaction (PCR) assay has been developed and used in the diagnosis of fatal and benign cases of Mediterranean spotted fever (MSF). The test was based on specific primers derived from a Rickettsia conorii 17-kD protein gene. A positive signal was obtained from spotted fever group (SFG) and typhus group (TG) rickettsiae. Discrimination between SFG and TG rickettsiae was based on a restriction fragment length polymorphism test. Other gram-negative bacterial species tested did not generate a signal, attesting for the specificity of the assay. The SFG-specific DNA fragment was detected in four of 29 acute-phase sera from serologically confirmed patients with MSF, while acute-phase sera from 25 patients without MSF were PCR negative. Acute-phase sera samples (five of five) and tissue autopsies (six of seven) from fatal suspected cases of MSF were PCR positive. The results demonstrate that sera and tissue samples are suitable specimens for the nested PCR tests, especially in fatal cases.     

先天性长QT综合征KCNQ1基因定点突变的研究

目的利用聚合酶链反应(PCR)技术对长QT综合征(LQTS)KCNQ1基因进行定点突变的研究。方法利用PCR定点突变技术，首先设计两对引物(包含预定的突变)，通过3轮PCR扩增，扩增出含有所需突变位点的片段，然后将片段克隆入T载体中，通过酶切连接的方法将突变点引入到pIRES2-EGFP-KCNQ1中，随后用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果在真核表达载体pIRES2-EGFP—KCNQ1基础上获得了KCNQ1 cDNA C682T的突变体，测序结果表明在序列中发生了预期的突变。结论KCNQ1定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

Screening for the familial defective apolipoprotein B-100 R3500W by mutagenic primers PCR

Individualswithhighplasmacholesterolareoftenpredisposedtoatherosclerosisandprematuredcoronaryhearddisease．TheplasmacholesterolconcentrationisregulatedmainlybythemetabolismofLDL，about２／３ofLDLiscleanedfromthecirculationbytheapoB－１００mediatedLDLrecep