氧应激对豚鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响及益心康胶囊含药血清保护作用的研究

目的观察氧应激对豚鼠心肌细胞线粒体的影响，探讨抗心肌缺血中药复方——益心康胶囊(H303)含药血清对氧应激损伤的保护作用机制。方法利用激光共聚焦显微镜，观察羟自由基损伤体系(Fe2＋／H2O2)与豚鼠心肌细胞共同孵育30～60min后对心肌细胞线粒体膜电位的影响。结果豚鼠心肌细胞氧应激后，可致线粒体细胞色素氧化酶活性降低，以及荧光染料Rh123所显示的线粒体膜电位明显降低。H303含药血清可明显减轻上述损伤，表现为明显增强豚鼠心肌细胞线粒体氧化酶活性，使心肌细胞存活率增加；并具有保护心肌细胞膜电位的作用。结论氧应激可造成心肌线粒体膜电位降低。益心康胶囊含药血清可保护线粒体膜电位，从而发挥其膜稳定作用。     

温下方含药血清对A549/DDP细胞内erbB-2、Topo-Ⅱ表达及铂含量的影响

目的:观察温下方不同剂量含药血清对A549/DDP细胞内表皮生长因子受体(erbB-2),DNA拓扑异构酶-Ⅱ(Topo-Ⅱ)表达及铂含量的影响.方法:将对照血清及不同剂量温下方含药血清作用于A549/DDP细胞,用免疫荧光技术、激光共聚焦显微镜检测erbB-2、Topo-Ⅱ表达,用激光流式细胞仪技术检测细胞内顺铂浓度.结果:温下方舍药血清能明显降低erbB-2表达(P＜0.05),明显提高Topo-Ⅱ表达及细胞内铂含量(P＜0.05).结论:温下方可能通过降低耐药细胞损伤后自我修复能力而逆转其耐药.     

柴胡疏肝散对大鼠胃Cajal间质细胞活性及细胞内钙离子浓度的影响

目的观察柴胡疏肝散含药血清对大鼠胃Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)活性及细胞内钙离子(Ca2+)浓度的影响。方法按照血清药理学通法制备大鼠含药血清,将血清分为柴胡疏肝散组(浓度为5%、10%、20%)、多潘立酮组(10%)、空白组,急性分离并采用酶解法提取胃窦ICCs进行常规培养,免疫荧光染色法鉴定ICCs,MTT法测定ICCs对数生长曲线,以含药血清继续培养对数生长期的ICCs 3天后,通过CCK-8法检测ICCs活性,激光共聚焦显微镜进行Fluo-3荧光检测ICCs细胞内Ca2+变化,比较各组含药血清对大鼠胃窦ICCs生长的影响。结果成功分离、培养和鉴定ICCs后,通过各组含药血清作用,与空白组同期比较,多潘立酮组、柴胡疏肝散组ICCs活性与细胞内Ca2+荧光强度均显著增强(P0.05);与多潘立酮组同期比较,10%、20%柴胡疏肝散组ICCs活性与细胞内Ca2+荧光强度均显著增强(P0.05);与5%柴胡疏肝散组同期比较,10%、20%柴胡疏肝散组ICCs活性(48、72 h)与细胞内Ca2+荧光强度均显著增强(P0.05)。结论柴胡疏肝散可以通过增强细胞内Ca2+浓度促进ICCs活性,促进其分化生长。     

扶正抑瘤颗粒含药血清对小鼠肝癌细胞H22凋亡及细胞内Ca2+浓度的影响

目的:观察扶正抑瘤颗粒(FYK)含药血清诱导小鼠肝癌细胞H22凋亡的作用及其对细胞内钙离子浓度的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法:FYK含药血清孵育体外培养的小鼠肝癌H22细胞,电子显微镜观察FYK含药血清诱导H22细胞凋亡的形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,激光共聚焦显微镜测细胞内钙离子浓度的变化。结果:FYK含药血清能诱导小鼠肝癌H22细胞发生凋亡,同时使细胞内游离钙离子浓度升高,并与剂量和时间存在依赖性关系,细胞内钙离子浓度与相同时间点凋亡率呈正相关。结论:FYK含药血清可通过改变细胞内钙离子浓度诱导细胞发生凋亡,这可能是其抗肿瘤作用的机制之一。     

抗纤Ⅰ号复方药物血清对肝星状细胞内钙离子浓度的影响

目的:研究抗纤Ⅰ号方药防治肝纤维化的分子机制,并探讨该药预防、治疗门脉高压的可行性.方法:制备大鼠含抗纤Ⅰ号药物血清,分别用药物血清和四氯化碳(CCl4)处理大鼠肝星状细胞(HSCs),作用24h后,以Fluo-3AM为细胞内Ca2 荧光指示剂负载细胞,通过激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2 的变化.采用正交设计方法,研究不同浓度CCl4、抗纤Ⅰ号方药物血清及其作用的先后顺序和二者作用的时间间隔对肝星状细胞内Ca2 浓度的影响.结果:不同浓度抗纤Ⅰ号方药物血清、CCl4及其作用的前后顺序对细胞内Ca2 浓度有显著影响,两因素作用的时间间隔对结果影响无显著性.CCl4在5mmol/L～15mmol/L范围内显著增加HSC内Ca2 浓度,5%～20%抗纤Ⅰ号方药物血清明显降低Ca2 浓度.结论:抗纤Ⅰ号方药物具有防治肝纤维化和门脉高压作用,其机理可能与其缓解细胞内钙超载有关.     

醒神喷鼻液对脑出血大鼠脑组织的钙离子浓度及线立体膜电位的影响研究

目的 观察醒神喷鼻液对脑出血模型大鼠脑组织的钙离子浓度、线粒体膜电位的影响.方法 SPF级SD大鼠随机分为醒神喷鼻液高、中、低剂量组、醒脑静组和模型对照组,各组大鼠滴鼻给药3d后,造脑出血模型,进行神经症状评分判断模型成功与否,造模成功动物再给药1天,24 h后断头取脑.应用流式细胞术测定脑组织的钙离子浓度和线粒体膜电位.结果 醒神喷鼻液能明显降低脑出血大鼠的神经症状评分,并呈一定量效关系.高、中剂量能降低模型大鼠脑组织的钙离子平均荧光强度,高剂量能升高线粒体膜电位的平均荧光强度.结论 醒神喷鼻液可抑制脑出血时脑组织的钙离子超载、保持线粒体膜电位的稳定,减轻脑损害程度,其作用机制可能与钙拮抗作用和细胞凋亡机制有关.提示脑出血时药物对脑细胞有保护作用.     

电针对神经病理性痛大鼠脊髓背角细胞内钙离子浓度以及钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响

目的:通过观察坐骨神经分支选择性损伤(SNI)大鼠脊髓背角神经细胞内钙离子([Ca2+]i)浓度以及钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的变化和电针干预对其的影响,探讨电针干预神经病理性痛的脊髓机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(AP-5)组和一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)组,每组22只。采用SNI法制备神经病理性痛模型,假手术组仅分离不结扎。电针组电针大鼠损伤侧委中环跳穴30min,1次/d,AP-5组予AP-5 0.7mg·kg-1·d-1腹腔注射,L-NAME组予L-NAME 60mg·kg-1·d-1腹腔注射,连续7d。造模前及SNI后10d、16d分别测定机械痛阈。激光共聚焦显微镜技术观察脊髓背角[Ca2+]i的荧光强度;Western blot和免疫组化法测定脊髓CaMKⅡ的表达。结果:与假手术组比较,SNI后10d各组机械痛阈值均降低(P0.01);与模型组比较,电针组、AP-5组和L-NAME组SNI后16d时机械痛阈值均升高(P0.01,P0.05)。与假手术组比较,模型组脊髓背角[Ca2+]i浓度与CaMKⅡ表达均升高(P0.01,P0.05);与模型组比较,电针组、AP-5组和L-NAME组脊髓背角[Ca2+]i浓度均被逆转(P0.05,P0.01),而CaMKⅡ的表达仅电针组被逆转(P0.05)。结论:电针减轻大鼠神经病理性痛的机制之一,可能与其有效下调脊髓背角[Ca2+]i浓度及CaMKⅡ的表达,继而抑制其一系列后效应有关。     

癌平口服液含药血清对人胃癌细胞凋亡的影响

目的：研究中药复方癌平口服液对人胃癌细胞凋亡的影响。方法：采用癌平口服液含药血清，温育体外培养的人胃癌细胞BGC-823，通过流式细胞仪细胞周期DNA含量分析，研究该方对体外培养的人胃癌细胞BGC-823凋亡的影响。结果：癌平口服液药物血清有诱导体外培养的人胃癌细胞BGC-823凋亡的作用。结论：诱导胃癌细胞凋亡是癌平口服液抗癌作用的机制之一。     

温下方含药血清诱导A549/DDP细胞凋亡及对Bcl-2,Bax,p53蛋白表达的影响

目的:研究温下方含药血清诱导人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP凋亡及对Bcl-2,Bax,p53蛋白表达的影响。方法:制备温下方含药血清,高效液相色谱法(HPLC)定性检测含药血清中人参皂苷Rb1、大黄素和乌头碱。A549/DDP细胞分为DDP干预组,含药血清+DDP干预组,正常血清+DDP干预组。孵育24 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,激光共聚焦显微镜检测Bcl-2,Bax及p53蛋白表达。结果:HPLC结果显示含药血清中含有人参皂苷Rb1、大黄素及乌头碱。含药血清作用后,与DDP干预组比较,含药血清+DDP干预组细胞凋亡率增高至(21.82±3.27)%(P<0.05);细胞内Bcl-2蛋白表达降低至2.81±0.02(P<0.05);Bax蛋白表达增高至2.90±0.08(P<0.05);p53蛋白表达增高至3.58±0.09(P<0.05)。结论:温下方含药血清明显诱导A549/DDP细胞凋亡,显著降低Bcl-2蛋白表达,提高Bax,p53蛋白表达,可能从诱导耐药细胞凋亡角度逆转耐药。     

荷瘤小鼠扶正抑瘤颗粒含药血清对H22细胞的凋亡、自由基含量和线粒体膜电位的影响

目的观察荷瘤小鼠扶正抑瘤颗粒（FYG）含药血清对H22细胞的凋亡、自由基含量和线粒体膜电位的影响。方法应用流式细胞仪检测FYG含药血清对H22细胞凋亡情况的影响;应用激光共聚焦显微镜检测H22细胞DNARNA、自由基含量和线粒体膜电位的变化。结果FYG含药血清可引起H22细胞的凋亡,细胞DNARNA和线粒体膜电位降低,自由基含量升高。结论FYK含药血清引起H22细胞的凋亡可能与其影响H22细胞自由基含量和线粒体膜电位变化有关。     

枸杞子含药血清对兔视网膜色素上皮细胞光损伤凋亡线粒体信号传导途径的影响

目的:研究兔视网膜色素(RPE)上皮细胞光损伤以及枸杞子含药血清干预防治后细胞中参与凋亡的蛋白分子表达量的变化,探讨枸杞子含药血清对兔视网膜色素上皮细胞光损伤保护可能的信号传导途径,为临床应用枸杞子治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜光损伤性疾病提供理论依据。方法:体外培养兔RPE细胞,用三基色冷光灯模拟自然光源,选取(2500±500)Lux作为基础光照强度,照射4h建立光损伤模型。制备含不同效量的枸杞子含药血清,光照前1h孵育体外培养的兔RPE细胞后进行光照实验,设置四个实验分组:A组:空白对照组;B组:光损伤模型组;C组:低剂量组;D组:高剂量组。通过透射电子显微镜进行兔RPE细胞超微结构的观察及拍片;采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测兔RPE细胞内细胞色素C(Cyt-C)、caspase-9及caspase-3蛋白的表达量。结果:与空白对照组相比,光损模型组细胞内的Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平明显上调(P0.05);枸杞子含药血清能有效的抑制细胞内Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达,与光损模型组比较,差异有统计学意义(均P0.05),其中高浓度组可显著抑制细胞内Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:枸杞子对RPE细胞具有一定的保护作用,这一保护作用可能是通过线粒体信号传导途径来实现的。     

不同浓度石斛合剂含药血清对β-Tc-6细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨不同浓度石斛合剂Ⅰ方和Ⅱ方含药血清对小鼠胰岛素瘤细胞株β-Tc-6增殖及凋亡的影响。方法将长满80%培养瓶的β-Tc-6消化后,接种于96孔板,1×104个细胞/孔,采用MTT法测吸光值A490,连续10d,绘制生长曲线;分别用20%、10%和5%的石斛合剂Ⅰ方或Ⅱ方含药血清作用于对数生长期细胞,48h后采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果β-Tc-6在第5前缓慢增殖,到第6天进入对数生长期,第9天后进入平台期。与对照组相比,10%石斛合剂Ⅰ方组可显著促进细胞增殖(P0.05);与对照组相比,三种不同浓度的石斛合剂Ⅰ方组及10%Ⅱ方组显著抑制细胞凋亡(P0.05,P0.01),与10%Ⅰ方组相比,20%Ⅰ方组和5%Ⅰ方组抑制凋亡更为显著,差异有统计学意义(P0.01,P0.05)。与对照组相比,20%Ⅱ方组显著促进细胞凋亡(P0.05)。结论石斛合剂Ⅰ方具有促进增殖及抑制凋亡的作用,其最佳作用浓度为10%;石斛合剂Ⅱ方对细胞增殖无显著性促进作用,但对细胞凋亡则依据不同浓度有显著性促进或抑制作用。     

风湿宁胶囊含药血清对JAK2/STAT3信号通路及相关细胞因子的影响

目的:探讨风湿宁(FSN)胶囊含药血清对JAK2/STAT3信号通路及相关细胞因子的影响。方法:采用Real-time PCR和Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察各组CIA-FLS细胞中P-JAK2、PSTAT3及其负反馈调节因子SOCS1和SOCS3的含量;采用Real-time PCR技术分别对各组CIA-FLS细胞中VEGF和RANKL的表达情况进行检测。结果:Tofacitinib含药血清+IL-6组、FSN含药血清+IL-6组CIAFLS细胞JAK2、STAT3的mRNA含量和蛋白表达都明显下降(P<0.05),该通路相关细胞因子VEGF和RANKLmRNA的含量也明显减少(P<0.05)。20%FSN含药血清+IL-6组CIA-FLS细胞SOCS3mRNA含量和蛋白表达上升(P<0.05),10%FSN含药血清+IL-6组中VEGF和RANKLmRNA的含量不同程度的减少(P<0.05)。结论:风湿宁胶囊含药血清可能通过对CIA-FLS细胞JAK2/STAT3信号通路的抑制作用进而影响了相关细胞因子VEGF和RANKL的表达,这也可能是风湿宁胶囊能够改善类风湿关节炎血管翳形成和骨破坏的机制之一。     

左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养MC3T3-E1细胞分化成熟过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:胰蛋白酶消化法传代培养MC3T3-E1细胞,通过血清药理学方法,设立正常对照组、左归丸组(5%、10%、15%)。分别用RT-PCR、Western blot法检测培养细胞第7、14、21天Cx43mRNA、蛋白表达;第21天划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能。结果:随着培养时间增加,各组MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达逐渐增强;GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异。各浓度左归丸含药血清均可促进培养细胞的Cx43mRNA和蛋白表达、增强GJIC功能,并与含药浓度正性相关,其中以10%组作用最显著(P0.05或P0.01)。结论:左归丸含药血清能增强MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达及GJIC功能,这可能是其促进MC3T3-E1细胞分化成熟的重要机制之一。     

旋覆代赭汤含药血清对胃窦平滑肌细胞IP_3受体及钙离子浓度影响的实验研究

目的:观察旋覆代赭汤含药血清对大鼠胃窦平滑肌细胞(SMC)IP3受体(IP3R)及钙离子(Ca2+)浓度的影响。方法:分离大鼠胃窦SMC,加入IP3受体拮抗剂肝素后,镜下观察含药血清对胃窦SMC收缩作用;检测细胞Ca2+总浓度。结果:IP3受体拮抗剂肝素可抑制旋覆代赭汤含药血清对胃窦SMC的收缩作用;各剂量组与无钙缓冲液组的细胞内钙离子总浓度相比较无明显差异。结论:旋覆代赭汤含药血清可使胃窦SMC收缩,其机制可能是通过IP3通路作用于细胞,引起细胞内质网释放Ca2+使胃窦SMCCa2+升高。     

痛风宁含药血清对尿酸盐诱导THP-1中NALP3炎性体相关蛋白及炎症因子表达的影响

目的通过检测痛风宁含药血清对尿酸盐(monosodium urate,MSU)诱导人单核细胞株THP-1(human monocytic cell line,THP-1)中NALP3炎性体相关蛋白与mRNA及上清液中IL-1β、PGE_2表达的影响,探讨痛风宁对痛风性关节炎的抗炎机制。方法制备低、中、高剂量痛风宁含药血清。将THP-1随机分为空白组和MSU干预组,MSU干预组予200 mg/L MSU混悬液诱导12 h建立炎症细胞模型,模型鉴定成功后采用随机数字表法分为模型组及低、中、高剂量痛风宁含药血清组(以下简称低、中、高剂量痛风宁组)、阳性对照组,分别予10%空白血清,10%低、中、高剂量痛风宁含药血清,10%空白血清+Caspase-1抑制剂干预,无MSU干预的空白组予10%空白血清干预。24 h后,离心收集各组THP-1及细胞上清液。采用ELISA检测各组细胞上清液中IL-1β、PGE_2含量,Western Blot、RT-qPCR分别检测各组THP-1中NALP3、Caspase-1、ASC蛋白及mRNA表达。结果与空白组比较,模型组NALP3、Caspase-1、ASC蛋白与mRNA表达及IL-1β、PGE_2含量均升高(P0.01);各剂量痛风宁组所有指标均低于模型组及阳性对照组(P0.01),同时低、高剂量痛风宁组所有指标水平均高于中剂量痛风宁组(P0.05,P0.01);阳性对照组Caspase-1蛋白表达及IL-1β、PGE_2含量低于模型组(P0.01),Caspase-1 mRNA、NALP3、ASC蛋白及mRNA表达与模型组差异无统计学意义(P0.05)。结论痛风宁对AGA的抗炎机制可能与抑制NALP3炎性体相关蛋白及mRNA表达,减少炎症因子IL-1β、PGE_2的产生有关。     

补中益气汤含药血清对caco-2细胞SGLT1、P38MAPK通路及NHE3表达影响的研究北大核心CSCD

目的探讨补中益气汤含药血清对人结肠腺癌细胞(caco-2细胞)钠葡萄糖共转运体蛋白1(SGLT1)、P38MAPK通路及钠-氢交换体3(NHE3)蛋白及基因表达的影响。方法根据血清药理学方法制备补中益气汤含药血清,将caco-2细胞分为正常组、根皮苷组、根皮苷+补中益气汤含药血清组和根皮苷+空白大鼠血清组。检测各组SGLT1蛋白和基因、P38MAPK/Ezrin通路蛋白和NHE3蛋白的表达。结果与根皮苷组比较,根皮苷+补中益气汤含药血清组caco-2细胞SGLT1蛋白表达有所上调(P <0.05),且呈浓度依赖关系;根皮苷+15%补中益气汤含药血清组caco-2细胞SGLT1mRNA,NHE3蛋白及P38MAPK/Ezrin通路磷酸化蛋白表达均有所增加,与根皮苷组比较差异有显著性(P <0.05);根皮苷+补中益气汤含药血清组的SGLT1mRNA及NHE3、P-P38MAPK、P-Ezrin蛋白表达均高于根皮苷+15%空白血清组,差异有统计学意义(P <0.05)。结论补中益气汤含药血清可上调caco-2细胞SGLT1的基因和蛋白表达、增加NHE3蛋白表达,这可能与其促进P38MAPK和Ezrin磷酸化有关。     

化瘀消癥颗粒含药血清对HTR-8/SVneo增殖侵袭迁移及FGA、ITGB3表达的影响

目的 研究化瘀消癥颗粒含药血清对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)增殖、侵袭、迁移以及纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain, FGA)、整合素β3(integrinβ3,ITGB3)表达的影响。方法 CCK8法检测化瘀消癥颗粒含药血清干预HTR-8/SVneo细胞的增殖情况;Transwell、细胞划痕分别检测化瘀消癥颗粒含药血清(低、中、高浓度组)对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响;qRT-PCR检测FGA、ITGB3 mRNA表达;Western blot检测FGA、ITGB3蛋白表达。结果 化瘀消癥颗粒含药血清高、中、低浓度组对HTR-8/SVneo细胞活性具有明显抑制作用。与对照组相比,各剂量化瘀消癥颗粒含药血清组对HTR-8/SVneo细胞增殖活性均有不同程度的抑制作用(P<0.05);不同剂量HTR-8/SVneo细胞穿过Transwell小室滤过膜数量均低于空白组,其中低剂量组HTR-8/SVneo细胞穿膜率最低(P<0.05)。化瘀消癥颗粒含药血清组FGA、ITGB3蛋白表达下调;低浓度化瘀消癥颗粒含药血清组FGA...     

血府逐瘀汤含药血清对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的研究血府逐瘀汤含药血清对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其机制。方法低氧诱导大鼠PASMCs增殖,设置正常对照组、低氧模型组、血府逐瘀低剂量组、血府逐瘀高剂量组和NVP-BEZ235组,血府逐瘀低、高剂量组含药血清浓度分别为5%和20%。运用CCK-8法检测不同低氧时间和药物干预对于PASMCs增殖的影响,Western Blot检测细胞p-Akt、p-mTOR和PCNA表达。结果低氧培养36 h时PASMCs OD值最高,且高于常氧培养(P0.01);与正常对照组比较,低氧模型组OD值明显升高(P0.01),p-AKT、p-mTOR、PCNA表达增加(P0.05);与低氧模型组比较,血府逐瘀高剂量组和NVP-BEZ235组OD值不同程度降低(P0.01),各药物组p-AKT、p-mTOR、PCNA表达减少(P0.05);与血府逐瘀低剂量组比较,NVP-BEZ235组p-AKT、p-mTOR、PCNA表达减少(P0.05)。结论血府逐瘀汤含药血清可以抑制低氧诱导的大鼠PASMCs增殖,可能通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路活化并下调PCNA表达而发挥作用。