日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

目的　免疫法筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S j) 15d肝期童虫cDNA表达文库 ,并进行鉴定 ,以获得S j疫苗候选抗原分子。方法　采用紫外线照射致弱尾蚴免疫的兔血清 ,对S j中国大陆株 15d肝期童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,选取部分阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列分析 ,将结果通过Internet送入NCBIGenBank进行同源性比较 ,并将发现的新基因送入GenBank登录。结果　对大约 10 4个噬菌斑进行了初筛 ,共获得 4 9个阳性克隆 ,复筛了其中的 12个克隆 ,获得 8个持续阳性反应克隆。对 6个克隆的核苷酸序列测定及同源性分析表明 ,2个为编码S j线粒体的基因 ,另外 4个为S j未知基因 ,新基因序列已被GenBank接受 ,并获得进入编号。 结论　从S j肝期童虫cDNA文库中筛选到一批S j基因 ,其中部分为未知基因 ,为血吸虫新的疫苗候选分子的研究提供了材料。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。     

日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选

目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。     

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。　方法　用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cD?鄄NA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出 6种蛋白分子基因 :3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。　结论　紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的筛选紫外线致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子,分析其主要表位,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法以紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,并利用软件Antheprot对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果经三轮筛选,共获20个阳性克隆,序列同源性分析表明其中有5种已知基因(GST、副肌球蛋白、肌球蛋白、钙离子激活蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶),6种未知基因,软件分析显示不同抗原分子分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能为潜在的日本血吸虫病疫苗分子,可能是多抗原、多表位在照射致弱尾蚴中起免疫保护作用。     

东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析

目的获得日本血吸虫病新的候选疫苗分子。方法用对日本血吸虫具有天然抗性的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库，阳性克隆转入E．coliBM25．8环化成质粒，抽提质粒DNA，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入片段进行核苷酸序列测序，并进行生物信息学分析。结果共获得12个不同的基因，插入片段长度为300～1100bp，其中2个具有完整的开放阅读框，为日本血吸虫新基因，命名为sj—sMf1和sj—sMf2，分别编码93个和61个氨基酸。前者含有cAMP磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点各1个，后者含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶c磷酸化位点。结论用东方田鼠血清作为探针筛选到2个日本血吸虫新基因。     

照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库

目的从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中获得日本血吸虫新的蛋白编码基因,为防治血吸虫病提供候选疫苗和治疗药物靶点.方法制备致弱尾蚴免疫兔血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,挑取阳性克隆,测序并进行生物信息学分析.结果共筛选出8个阳性克隆,长度分布于0.6～3.0kb.随机选取4个阳性克隆进行PCR扩增及测序,获得2个日本血吸虫新基因:整合酶相似蛋白编码基因和蛋白磷酸酶1催化亚单位编码基因.前者长度为636 bp,含一个462 bp完整开放阅读框(ORF);后者1 879 bp,含一个984 bp完整ORF.两者GenBank的登录号分别为:AY855919、AY879341.结论致弱尾蚴免疫兔血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针;发现了2个日本血吸虫新基因.     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。　方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。　结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 ,全长 14 3 9bp ,编码 44 3个氨基酸 ,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有 79%的同源性。编码蛋白的理论分子质量为 7.2 198ku ,等电点为 9.12 ;抗原表位可能位于cDNA序列 3 73～ 3 96处。　结论　表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果获得了1个日本血吸虫新基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子质量为7．2198ku，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

日本血吸虫中国大陆株肝期童虫cDNA文库的构建及鉴定

目的　构建日本血吸虫肝期童虫的cDNA文库 ,以从中寻找新的抗病疫苗和诊断分子。方法　阳性钉螺逸出尾蚴 ,人工感染家兔 ,15d后剖杀家兔 ,门静脉灌洗收集童虫。提取其总RNA ,并反转录PCR合成cDNA ,将cDNA片段定向重组入噬菌体载体 ,包装后构建成cDNA文库。结果　反转录PCR产生的cDNA经电泳 ,分子量大小位于 4 0 0～ 35 0 0bp之间 ,经含有IPTG和x -Gal颜色选择平皿测定 ,初步提示重组效率为 90 %以上。随机挑取 6个重组克隆经自身环化成质粒后双酶切鉴定提示插入片段 4 0 0～ 12 0 0 pb不等。 结论　首次成功构建日本血吸虫肝期童虫cDNA文库     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

日本血吸虫童虫文库免疫筛选及其高丰度表达膜蛋白初步鉴定

目的 获得新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子并对其鉴定。 方法 免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库，对获得的阳性克隆进行测序分析，设计引物体外扩增目的蛋白基因，将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，并转化大肠埃希菌BL21，进行诱导表达，最后用Western blotting鉴定。 结果 获得34个阳性克隆，选择其中24个进行测序，其中13个是日本血吸虫相对分子质量（Mr）为22 600膜相关蛋白（Sj22.6）基因。Sj22.6基因在体外被成功扩增，并被亚克隆入pET28a中进行表达。Western Blotting 结果显示，菌体表达的条带可以被感染兔血清以及血吸虫患者血清识别。 结论 Sj22.6膜相关蛋白基因在童虫cDNA文库中可以被高频率筛出，融合蛋白Sj22.6成功地在BL21中表达并具有免疫反应性。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

PCR扩增日本血吸虫Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因的诊断作用

目的 探讨PCR扩增日本血吸虫Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因的诊断价值.方法 从40例慢性日本血吸虫病患者血清中提取13本血吸虫DNA,用PCR扩增Si26、Sj32和sjl4-3-3抗原编码基因.1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以21例华支睾吸虫病、13例卫氏并殖吸虫病患者血清和43例健康人血清作对照.结果 从慢性日本血吸虫病患者血清中可扩增出长度为399 bp的Sil4-3_3抗原编码基因片段,但未扩增出长度为676 bp的Si26和1270 bp的Sj32抗原编码基因片段.对照组均呈阴性反应.结论 PCR扩增Sjl4-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断.

Abstract：

Objective To investigate the diagnostic value of coding gene of Sj26, Sj32 and Sj14-3-3 amplified by PCR for chronic Schistosomiasis japonica. Methods The DNA was extracted from sera of 40 patients with chronic Schistosomiasis japonica, the coding gene of Sj26, Sj32 and Sj14-3-3 was amplified by PCR and identified by 1.2% agarose gel electrophoresis. DNA from the sera of 21 patients with Clonorchiasis sinensis, 13 patients with Parogonimiasis westermani and 43 healthy donors was taken as control. Results A total of 399 bp coding gene of Sj14-3-3 was amplified successfully from sera of the patients with chronic Schistosomiasis japonica,but Sj26(676 bp) and Sj32( 1270 bp) coding gene were not obtained. Control groups were all negative. Conclusions Sj14-3-3 coding gene amplified by PCR can be used for genetic diagnosis of chronic schistosomiasis.     

RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的研究

目的探讨RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的价值。方法从慢性日本血吸虫病患者血清中提取总RNA,用RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因,以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型包虫病、囊型包虫病、乙型肝炎、肺结核患者血清和健康人血清作为对照。结果 RT-PCR扩增出约400 bp的Sj14-3-3抗原编码基因片段,但未扩增出676 bp的Sj26和1 270bp的Sj32抗原编码基因片段。对照组呈阴性反应。结论 RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断。     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

双嗜性逆转录病毒感染日本血吸虫细胞的生物学理论与可行性探讨

目的探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫（Sj）细胞的生物学理论与实验依据。方法用生物信息学方法对双嗜性逆转录病毒rRam-1受体同源性分布、结构与功能作系统的分析与比较;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞,经PCR和RT-PCR检测感染细胞目的基因（E77.43）的整合与表达。结果根据生物信息学分析结果推断,Sj细胞膜上存在的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种蛋白为非分泌性跨膜蛋白,可能具有细胞膜离子转运通道或受体蛋白的功能及双嗜性逆转录病毒感染的膜受体样作用,可能参与病毒对细胞的吸附和穿入过程;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞后,用PCR及RT-PCR检测到目的基因整合与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。结论用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。研究结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因到Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。