肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群的分离及其特性的研究

目的:研究CD133在人肝癌细胞系Huh-7中的表达,初步探讨肝癌中CD133阳性细胞亚群的干细胞特性.方法:流式细胞荧光激活分选技术纯化肝癌细胞系Huh-7中CD133肿瘤细胞,体外培养并观察其增殖、体内成瘤及分化能力.结果:流式细胞仪检测肝癌细胞系Huh-7中有62.3%的细胞CD133呈阳性表达,流式细胞荧光激活分选的CD133肿瘤细胞在无血清培养基中第3、5、7d的吸光度(OD值)分别为0.310、0.362、0.564,均高于相同条件下未分选细胞和CD133阴性细胞;CD133阳性细胞亚群成瘤能力明显强于阴性细胞亚群;CD133阳性细胞亚群在培养体系中的比例逐日下降,至培养的第8天,由第1天的92.3%下降至61.4%.结论:肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群比其它细胞亚群具有较强增殖、成瘤和分化能力,是具有肝癌干细胞特性的细胞亚群.     

肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群的分离及其特性的研究

目的：研究CD133在人肝癌细胞系Huh-7中的表达,初步探讨肝癌中CD133阳性细胞亚群的干细胞特性。方法：流式细胞荧光激活分选技术纯化肝癌细胞系Huh-7中CD133肿瘤细胞,体外培养并观察其增殖、体内成瘤及分化能力。结果i流式细胞仪检测肝癌细胞系Huh-7中有62．3％的细胞CD133呈阳性表达,流式细胞荧光激活分选的CD133肿瘤细胞在无血清培养基中第3、5、7d的吸光度（OD值）分别为0．310、0．362、0．564,均高于相同条件下未分选细胞和CD133阴性细胞;CD133阳性细胞亚群成瘤能力明显强于阴性细胞亚群;CD133阳性细胞亚群在培养体系中的比例逐日下降,至培养的第8天,由第1天的92．3％下降至61．4％。结论：肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群比其它细胞亚群具有较强增殖、成瘤和分化能力,是具有肝癌干细胞特性的细胞亚群。     

人肺癌A549细胞系肿瘤干细胞的筛选和鉴定

背景与目的肺癌干细胞是肺癌恶性表型的根源和潜在的治疗靶点,从人肺癌A549细胞株中分离肺癌干细胞,观察特异性干细胞标志物分子的表达,为进一步的干细胞研究提供试验基础。方法接种肺癌A549细胞株,经流式细胞术,特异性筛选分离肺癌干细胞,观察克隆形成能力、细胞增殖能力和体外致瘤能力的差别,并分别用RT-PCR和Westernblot的方法分析干细胞标志物分子CD133和ABCG2的表达。结果经过流式细胞仪成功分选了人肺腺癌A549细胞系SP细胞亚群,结果表明此SP细胞亚群约占A549细胞总数的5.93%,经维拉帕米处理后Hoechest33342阴性/弱阳性细胞含量下降为0.32%,SP细胞克隆形成能力,细胞增殖能力和体外致瘤能力均明显高于非SP细胞。RT-PCR和Westernblot结果发现,筛选分离的肺癌SP细胞群高表达干细胞标志物分子CD133和ABCG2。结论通过流式细胞术可以筛选分离高表达CD133和ABCG2分子的肺癌干细胞,可用于进一步的研究中。     

肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞的生物学功能研究

探讨肺癌A549细胞株中具有肿瘤干细胞特性的ALDH1+细胞的生物学功能特性。方法:运用流式细胞仪分选肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞,并通过肿瘤球培养、MTT实验、平板克隆、Transwell小室迁移实验、裸鼠体内成瘤实验来验证ALDH1+细胞的自我更新、增殖克隆、迁移及致瘤能力。结果:ALDH1+ A549细胞的肿瘤球形成能力、增殖克隆、迁移和体内成瘤能力明显高于ALDH1- A549细胞和未经分选的A549细胞。结论:A549细胞株中ALDH1+ A549细胞具有自我更新、增殖、迁移和高致瘤能力的肿瘤干细胞特性,ALDH1可作为分选肺癌肿瘤干细胞的标志物。      

人肺腺癌A549细胞系SP细胞亚群生物学特性的体外实验研究

目的:探讨人肺腺癌A549细胞系SP细胞亚群体外培养的生物学行为特征.方法:免疫组化方法检测A549细胞系AB-CG2蛋白的表达;流式细胞仪分选A549细胞系SP细胞和非SP细胞亚群,用RT-PCR方法检测两亚群细胞ABCG2基因的表达;并通过两亚群细胞的生长曲线、细胞分裂指数、细胞周期各时相分布以及平板克隆形成实验、迁移和侵袭研究两亚群细胞的生物学行为.结果:A549细胞系ABCG2蛋白表达的阳性率约为2%;SP细胞表达ABCG2,而非SP细胞则不表达;两亚群细胞的增殖和迁移能力相似(P＞0.05);SP细胞的克隆形成率和侵袭能力则大于非SP细胞(P＜0.05).结论:A549细胞系SP细胞亚群体外成瘤能力及侵袭能力强于非SP细胞亚群,SP细胞亚群可能富集了肿瘤干细胞.     

人乳腺癌MCF-7细胞中SP亚群细胞的分离及其生物学行为研究

目的:了解肿瘤干细胞的生物学行为及相关的调控机制.方法:采用干细胞对Hoechst33342染料外排的特性进行MCF-7 细胞系肿瘤干细胞的流式分选.并对其增殖、自我更新、分化能力等生物学行为进行研究.还利用流式细胞仪、免疫荧光技术、荧光定量PCR等技术进行了与干细胞生物学行为密切相关的Wnt信号转导通路中相关分子的表达特征研究.结果:MCF-7细胞系中包含SP亚群(side population);且SP细胞具有分化潜能,高增殖能力,及自我更新特性;而且Wnt通路的各种关键分子在该细胞系SP亚群细胞中呈活化状态.结论:MCF-7细胞系的SP亚群可以代表该细胞系的肿瘤干细胞,Wnt通路在该肿瘤细胞系肿瘤干细胞的自我更新等其它生物学行为的调控中起重要作用.     

喉癌细胞CD44+CD133+高致瘤亚群的生物学特性

目的 筛选喉癌细胞中的高致瘤亚群,探讨其作为肿瘤干细胞的生物学特性.方法 原代培养喉癌细胞,采用流式细胞仪分选CD44+、CD133+、CD44+CD133+、CD44+CD133-细胞,并分别以1×106、1×105、1×104、1×102个/只接种于裸小鼠左腋皮下,观察各亚群成瘤时间、成瘤率、平均瘤重及肿瘤体积,筛选出在极低细胞浓度下的高致瘤亚群.采用Boyden小室体外侵袭实验,检测各亚群细胞的侵袭能力.采用免疫细胞化学染色检测各亚群细胞中干细胞抗原-1(SCA-1)及整合素β1的表达.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法,检测各亚群细胞中Bmi-1基因的表达.结果 CD44+CD133+细胞以1×103个/只接种于裸小鼠,可以成瘤.当各亚群细胞以1×106个/只接种于裸小鼠4周后,CD44+CD133+细胞接种组棵小鼠的肿瘤体积和重量分别为(7726.81±196.93)mm3和(5.51±0.12)g,均大于CD44+、CD44+CD133-及未分选细胞接种组(均P<0.05),而与CD133+细胞接种组裸小鼠的肿瘤体积和重量差异无统计学意义(P>0.05).CD44+CD133+细胞24 h的侵袭细胞数为83.62±1.61,显著高于其他各亚群喉癌细胞.CD44+CD133+细胞高表达整合素β1和SCA-1.Bmi-1 mRNA在CD44+CD133+细胞中的表达水平为0.951±0.112,显著高于CD44+CD133-细胞和未分选的喉癌细胞(0.532±0.214和0.268±0.193,均P<0.01);Bmi-1蛋白在CD133+和CD44+CD133+细胞中高表达,而在CD44+、CD44+CDi33-和未分选的喉癌细胞中仅有少量表达.结论 CD44+CD133+喉癌细胞具有高致瘤性及肿瘤干细胞的生物学特性,可能是喉癌恶性增殖的根源,并有望成为喉癌治疗的新靶点.     

不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新和致瘤能力差异

目的 分析原代培养乳腺癌细胞中不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新、致瘤能力差异。方法 采用流式细胞术和免疫荧光实验,从乳腺癌原代培养细胞中分选、鉴定CD44⁺CD24^-/low、ALDH1⁺和ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low细胞亚群,分析各分选细胞占总肿瘤细胞的比例;通过克隆形成实验观察各组细胞的自我更新能力;通过裸鼠致瘤实验观察各组细胞的致瘤能力。结果 CD44+CD24^-/low细胞占总细胞比例的7.2%,ALDH1⁺细胞所占比例为4.6%,ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low细胞所占比例为1.5%。三组细胞自我更新和致瘤能力由强至弱依次为ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low、ALDH1⁺、CD44⁺CD24^-/low细胞,各组细胞间比较差异均存在统计学意义（P<0.05）。 结论 乳腺癌组织中CD44+CD24-/low、ALDH1⁺和ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low三组乳腺癌干细胞亚群之间的自我更新和致瘤能力有明显差异,ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low亚群细胞具有最强的自我更新和致瘤能力,提示ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low可能是更具有特异性的乳腺癌干细胞标志物。     

人结肠癌细胞系肿瘤干细胞特性的初步研究

目的:本研究对8种人结肠癌细胞系的干细胞特性进行初步检测,以寻找适合分选结肠癌干细胞的细胞系.方法:利用流式细胞术,RT-PCR检测8种结肠癌细胞中CD133的表达情况;利用条件培养观察8种细胞系的肿瘤细胞在无血清培养基中的生物学特性;利用裸鼠成瘤模型检测成瘤能力和转移能力.结果:CD133在8种细胞系中的表达有显著差异,最高的HCT116细胞系中CD133+细胞含量为(91.4±5.0)%;各种细胞系细胞均能在无血清培养基中增殖,但只有HCT116细胞能形成典型的"神经球样结构"且具有较高的成瘤能力和转移能力.同等细胞浓度下移植瘤体积HCT116(1.06±0.13) cm3, LOVO(0.22±0.09) cm3, P=0.01, 差异具有统计学意义.结论:相对于其他7种细胞系,HCT116细胞具有多种肿瘤干细胞的生物学特性,更适合于结肠癌干细胞的研究.     

外阴鳞状细胞癌肿瘤干细胞的分选和鉴定

目的:分离外阴鳞状细胞癌A-431细胞系中CD44+的细胞亚群,鉴定其具有肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞术分选出CD44免疫荧光抗体标记的CD44+细胞亚群,检测CD133、CD34蛋白在CD44+和CD44-中表达的差异,检测CD44+及CD44-细胞亚群的细胞周期。结果:A-431细胞系中CD44+细胞亚群约占4%,胚胎干细胞因子CD133、CD34在CD44+和CD44-的VSCC中表达存在显著性差异,主要在细胞膜上表达,CD44+的肿瘤细胞亚群97.69%处于G1期,CD44-的肿瘤细胞亚群61.12%处于S期。结论:在 A-431细胞系中 CD44 可以作为分选肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD133、CD34 在 CD44+的肿瘤细胞高表达,可能成为分选外阴鳞癌肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD44+肿瘤细胞具有典型的干细胞增殖特点。     

褪黑素通过促凋亡协同增强顺铂对人喉癌细胞增殖的抑制作用

目的:研究褪黑素(melatonin,MT)对人喉癌细胞增殖与凋亡的影响及MT增强人喉癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)治疗的敏感性.方法:采用不同质量浓度MT和DDP单独或联合处理Hep-2细胞;通过CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,采用两药相互作用指数(co-efficient of drug interaction,CDI)评估MT是否影响Hep-2细胞对DDP的敏感性.结果:CCK-8检测结果显示,单用MT或DDP可浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,MT可协同增强DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用(CDI＜1).流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期结果显示,MT可促进Hep-2细胞凋亡以及增加亚G1期细胞比例(P＜0.01),MT可协同DDP促进Hep-2细胞凋亡[0.5 mmol/L MT联合20μg/ml DDP组的细胞凋亡率显著高于20 μg/ml DDP组,(40.9±3.0)％vs(11.0±0.9)％,P＜0.01]以及亚G1期细胞比例[0.5 mmol/L MT联合20 μg/mlDDP组的亚G1期细胞比例显著高于20 μg/ml DDP组,(73.0±2.4)％vs(40.4±3.0)％,P＜0.01].加入Caspase抑制剂Z-VAD-fmk可逆转MT和/或DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用(均P＜0.01).结论:MT能以Caspase依赖的方式诱导人喉癌细胞Hep-2的凋亡,从而协同增强DDP对细胞的增殖抑制作用.     

乙醛脱氢酶1A1过表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）过表达对胃癌细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的影响。方法 成功构建过表达ALDH1A1的pEGFP-N1-ALDH1A1真核载体并转染至人胃癌细胞株MKN-28（实验组）,同时设空载体组（转染空载体pEGFP-N1的MKN-28细胞）和空白对照组（未行任何干预措施的MKN-28细胞）,分别于转染96 h后采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、克隆形成实验及Transwell小室侵袭实验检测ALDH1A1过表达对MKN-28细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的影响。结果 实验组转染96 h后的增殖抑制率为（19.26±2.01）％,均低于空载体组和空白对照组,而克隆形成率和穿膜细胞数分别为（25.44±1.74）％和（219.78±12.93）个,均高于空载体组和对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组和空载体组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 在MKN-28细胞中过表达ALDH1A1,可增强肿瘤细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力,提示ALDH1A1可能参与了胃癌的发生、发展。     

耐顺铂卵巢癌患者腹水中ALDH1阳性肿瘤细胞的生物学特性

目的:探讨卵巢癌顺铂耐药患者腹水中ALDH1阳性肿瘤细胞的生物学特征。方法:从卵巢癌顺铂耐药患者腹水中分离癌细胞,流式分选法得到 ALDH1阳性和ALDH1阴性细胞,荧光定量RT-PCR检测两组细胞的干细胞标志CD44、CD90、CD133及上皮间质化相关标志E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及Fibronectin在mRNA水平的表达,MTT法测定细胞增殖曲线和对顺铂的耐药指数,Transwell 小室侵袭实验、克隆形成实验、悬浮成球实验分别观察细胞侵袭能力、增殖分化能力及干细胞的潜能。结果:与ALDH1阴性细胞相比,ALDH1阳性细胞的干细胞标志CD44、CD90、CD133表达升高,上皮化标志E-cadherin降低,间质化标志 N-cadherin、Vimentin表达明显升高。MTT测定生长曲线显示ALDH1阳性细胞增殖明显增快,对顺铂的耐药指数为14.2,ALDH1阳性细胞的穿膜细胞数、克隆形成数以及成球数目显著高于ALDH1 阴性细胞 (P<0.05)。结论:ALDH1阳性细胞具备干细胞特征,其耐药性和侵袭能力增强。     

鸦胆子油乳对Hep-2细胞增殖与凋亡诱导作用的研究

目的：探讨鸦胆子油乳注射液对喉癌Hep-2细胞的增殖抑制及调亡诱导作用。方法：利用MTT比色法检测5个不同药物浓度（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8g/L）对细胞的抑制率;采用倒置显微镜观察细胞的形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡基因Bcl-2和Bax的表达。结果：MTT显示,鸦胆子油乳对Hep-2细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性。倒置显微镜下可见细胞凋亡的形态学改变,显示加药组细胞染色体固缩,聚集呈块状、新月状,出现凋亡小体。流式细胞仪检测显示,0.2、0.4和0.6g/L药物作用48h后凋亡率分别为（42.58±4.36）%、（57.71±3.07）%和（75.50±3.93）%,显著高于对照组（0.96±0.17）%,差异有统计学意义,F=8.82,P=0.003;实时荧光定量PCR结果显示,随着鸦胆子油乳注射液的浓度增加,Bcl-2mRNA的表达减少,Bax mRNA的表达量逐渐上升,与对照组比较差异有统计学意义,P〈0.01。结论：鸦胆子油乳能够抑制Hep-2细胞的增殖并诱导其凋亡,作用呈剂量和时间依赖性。     

沉默HIG2促进NK细胞对喉癌细胞杀伤敏感性的机制探讨

目的:探讨缺氧诱导基因2（HIG2）在喉癌细胞逃逸NK细胞免疫杀伤中的作用机制。方法:免疫组织化学法检测喉癌组织和癌旁组织中HIG2的表达;Western blot检测HIG2、NKG2D配体（MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3）的蛋白表达;Transwell实验检测Hep-2细胞的侵袭;流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡、CD3-CD56+的NK细胞纯度、NKG2D受体表达及Hep-2细胞NKG2D配体的表达;乳酸脱氢酶释放法检测不同效靶比时,NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性。结果:HIG2在喉癌组织中高表达。CD3-CD56+的NK细胞纯度大于90%。沉默HIG2抑制Hep-2细胞侵袭,促进细胞凋亡,提高NKG2D配体的表达,增强NK细胞对Hep-2细胞的杀伤敏感性。NKG2D抗体抑制NK细胞NKG2D受体表达,减弱NK细胞对沉默HIG2 的Hep-2细胞的杀伤活性。结论:沉默HIG2可抑制喉癌细胞侵袭,促进细胞凋亡,上调NKG2D配体表达,增强NK细胞对喉癌细胞的杀伤敏感性。     

姜黄素调控Notch信号通路对肺癌干细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究姜黄素对肺癌干细胞增殖及凋亡的影响。方法:利用免疫磁珠标记肺癌表面标记物乙醛脱氢酶1(ALDH1)，从肺癌A549细胞系中分离肺癌干细胞；MTT实验检测姜黄素对肺癌干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测姜黄素对肺癌干细胞凋亡的影响；Western blot检测Notch1和Hes1蛋白的表达情况；抑制剂γ-分泌酶抑制Notch信号通路研究对肺癌干细胞增殖及凋亡的影响。结果:利用免疫磁珠分选法分选出肺癌细胞系A549中ALDH1+肺癌干细胞。MTT检测结果显示，姜黄素能够呈浓度依赖性的抑制肺癌干细胞的增殖；经姜黄素处理后的肺癌干细胞，与对照组相比，凋亡率明显升高，Notch1和Hes1蛋白的表达明显下降。经γ-分泌酶抑制剂处理肺癌干细胞后，实验结果显示，γ-分泌酶抑制剂通过下调Notch1和Hes1蛋白的表达调控Notch信号通路抑制肺癌干细胞的增殖，诱导其凋亡。结论:姜黄素抑制肺癌干细胞的增殖，诱导其凋亡与Notch信号通路有关。     

乙醛脱氢酶阳性乳腺癌干细胞的分离培养及其生物学特性分析

 目的　证实人类乳腺癌MCF-7细胞系中存在ALDH+乳腺癌干细胞,并研究ALDH+乳腺癌干细胞体外增殖、侵袭能力等生物学特性。方法　应用流式细胞术从MCF-7细胞中分离并培养ALDH+ 乳腺癌干／祖细胞,通过划痕试验、MTT法生长曲线测定、以及Transwell法等检测ALDH+乳腺癌干细胞的生物学特性。结果　MCF-7细胞系中,CD-／low24 CD+44 细胞比例约为1.4 %,ALDH+ CD-／low24 CD+44 细胞比例约为1.2 %; ALDH+乳腺癌干细胞与CD-／low24 CD+44 细胞两者的生长曲线基本一致;CD-／low24 CD+44 ,ALDH+ CD-／low24 CD+44 组细胞划痕区细胞间距离明显缩短,其迁移能力明显强于对照组,且两群干细胞之间存在差异;Transwell实验结果,与对照组相比,CD-／low24 CD+44 、ALDH+ CD-／low24 CD+44 两组细胞有大量细胞过膜,三组MTT检测吸光度值分别为1.05±0.098、1.56±0.075、1.67±0.032。结论　MCF-7细胞系中存在CD-／low24 CD+44 和ALDH+ CD-／low24 CD+44 乳腺癌干细胞,ALDH可以作为鉴定乳腺癌干细胞的分子标志之一。     

Expression and functional role of ALDH1 in cervical carcinoma cells

Tumor formation and growth is dictated by a very small number of tumor cells, called cancer stem cells, which are capable of self-renewal. The genesis of cancer stem cells and their resistance to conventional chemotherapy and radiotherapy via mechanisms such as multidrug resistance, quiescence, enhanced DNA repair abilities and anti-apoptotic mechanisms, make it imperative to develop methods to identify and use these cells as diagnostic or therapeutic targets. Aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) is used as a cancer stem cell marker. In this study, we evaluated ALDH1 expression in CaSki, HeLa and SiHa cervical cancer cells using the Aldefluor method to isolate ALDH1-positive cells. We showed that higher ALDH1 expression correlated with significantly higher rates of cell proliferation, microsphere formation and migration. We also could demonstrate that SiHa-ALDH1- positive cells were significantly more tumorigenic compared to SiHa-ALDH1-negative cells. Similarly, SiHa cells overexpressing ALDH1 were significantly more tumorigenic and showed higher rates of cell proliferation and migration compared to SiHa cells where ALDH1 expression was knocked down using a lentivirus vector. Our data suggested that ALDH1 is a marker of cervical cancer stem cells and expand our understanding of its functional role.     

缺氧对喉癌Hep-2细胞HIF-1α、GLUT-1、MMP-2表达的影响

目的 探讨缺氧对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响。方法 MTT法检测缺氧不同时间点细胞增殖状况;Transwell和划痕实验分别检测缺氧对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺氧后不同时间点HIF-1α、GLUT-1、MMP-2蛋白及mRNA表达的情况。结果 在缺氧条件下（1％O2、5％CO2和94％N2）,Hep-2细胞的存活率随缺氧时间的延长逐渐升高,迁移和侵袭能力增强;随缺氧时间延长,Hep-2细胞HIF-1α蛋白表达水平明显增加,mRNA水平变化不明显;随缺氧时间延长,GLUT-1、MMP-2的mRNA水平和蛋白水平均明显增加。 结论 缺氧环境下,喉癌肿瘤细胞通过上调HIF-1α、GLUT-1、MMP-2的表达,强化其增殖、侵袭、转移的能力,促进喉癌的发展。