丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小鼠及家兔中免疫应答的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)及恶性疟原虫 (Pf)复合DNA疫苗的可行性。方法 :把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中 ,构建真核表达载体pcDNA3 CAB ,肌肉注射免疫小鼠及家兔 ,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果 :小鼠及家兔分别于免疫后第 6周及第 8周可检测到抗GZ PCX抗体 ,于第 10周达最高 ,滴度分别为 1:40 0及 1:3 2 0 0 ,但持续时间较短 ;免疫血清可识别Pf抗原 ;免疫动物还可产生针对GZ PCX融合蛋白的迟发性超敏反应 ;免疫后小鼠体重正常 ,肝脾脏未见明显肿大 ,具有良好的安全性。结论 :HCV Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答 ,但抗体的持续时间较短。     

HCV/HBV复合DNA免疫的初步研究

目的 探讨HCV/HBV复合抗原PCX/S免疫原性。方法 将已证实具有良好免疫原性的人工合成的HCV复合多表位抗原基因PCX与HBV的S抗原基因融合于真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达载体pcDNA-PCXS。大量提取质粒并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR渗入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;用~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果 免疫后均能检测到抗-HBsAb和抗-HCVAb,抗体水平随着时间的推移逐渐升高,但后者OD_(450nm)平均值低于抗-HBsAb的OD_(450nm)。免疫小鼠诱发针对PCX或S抗原的CTL反应和淋巴细胞转化。结论 复合型PCX/S抗原基因可诱发特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小？…

目的：探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）及恶性疟原虫（Ｐｆ）复合ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：把ＨＣＶ复合多表位抗原基因ＰＣＸ与Ｐｆ复合基因ＡＢ克隆到带ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建真核表达载体ｐｃｄＤＮＡ３／ＣＡＢ,肌肉注射免疫小鼠及家兔,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果：小鼠及家兔分别于免疫后第６周及第８中检测到抗ＧＺ－ＰＣＸ抗体,于第１０周达最高,滴度分别为１：４００及１：３２     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

弓形虫多表位DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果.方法:将编码含弓形虫多个T、B细胞表位的6段弓形虫多肽基因,以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成多表位弓形虫DNA疫苗.免疫BALB/c小鼠,测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况,同时进行弓形虫攻击感染保护实验.结果:成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/T-ME,以其作为DNA疫苗免疫小鼠,可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答,产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答.结论:构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答,在控制弓形虫感染上具有可行性.     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。     

CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用

目的 :构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗 ,并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用。方法 :抽提CVB3RNA ,以RT PCR扩增VP1基因 ,克隆于真核表达载体 pcDNA3中 ,构建质粒pcDNA3 VP1。将该质粒转染Hela细胞 ,观察其表达情况 ;以 5 0 μgpcDNA3 VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠 3次 ,检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答。间隔 4wk以 5×LD50 的CVB3攻击小鼠 ,观察攻击后小鼠的存活情况。结果 :构建了重组质粒 pcDNA3 VP1,并在体外获得有效表达。以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠 ,可诱生高水平的IgM和IgG ,VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于 pcDNA3免疫的对照组。病毒攻击试验表明 ,pcDNA3 VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活 ,其心肌组织未见明显的病理学改变 ;而对照小鼠平均仅存活 6 .7d ,心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润。结论 :pcDNA3 VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答 ,保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

B细胞趋化因子对CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响

目的:探讨B细胞趋化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)对柯萨奇病毒B3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响。方法:将BALB/c小鼠随机分为4组,分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/BLC、pcDNA3/C3d3-sVP1和含pcDNA3/BLC与pcDNA3/C3d3-sVP1的混合质粒,于免疫后不同时间检测小鼠血清的中和抗体滴度、特异性CTL杀伤活性;以LD50的CVB3病毒液感染已免疫小鼠,检测小鼠血中病毒滴度,观察存活情况以评价各种疫苗的免疫保护作用。结果:小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,混合组中和抗体滴度(42.17±1.43)和特异性CTL杀伤率(41.3%±3.51%)均明显高于pcDNA3/C3d3-sVP1组(P0.05),而血中病毒滴度低于pcDNA3/C3d3-sVP1组;经致死量CVB3感染后,pcDNA3/BLC和pcDNA3/C3d3-sVP1混合免疫的小鼠生存率达44%,生存率高于其他各组。结论:BLC可显著提高C3d3-sVP1基因诱导的特异性免疫应答,增强基因疫苗对机体的免疫保护作用。     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答

目的 :检测表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答效果。方法 :将真核表达质粒pVAXGE肌肉注射BALB C小鼠 ,观察免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群的数量、特异性CTL杀伤率及小鼠免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度。结果 :重组质粒pVAXGE免疫组小鼠脾淋巴细胞进行了增殖 ,脾特异性CTL杀伤率显著高于对照组 (P <0 0 1) ;小鼠免疫后于第 8周血清抗体达到最高。结论 :表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗质粒可诱导BALB C小鼠发生免疫应答     

Immunization with a synthetic multiepitope antigen induces humoral and cellular immune responses to hepatitis C virus in mice

The immunogenicity of a synthetic multiepitope PCX3 antigen, which contains triple tandem repeats of five conserved epitopes from hepatitis C virus (HCV) polyprotein, was studied in BALB/c mice given three intraperitoneal injections of antigen with Freund's adjuvant. Both a strong antibody response and specific cytotoxic T lymphocytes were induced. The specific anti-PCX3 IgG was able to bind HCV particles from hepatitis C patient sera by incubation overnight. In particular, in transgenic mice with chimeric human livers, anti-PCX3 antibody was able to lower the viral load in two of five mice and to eliminate HCV infection in three of five mice by 2 wk after inoculation with HCV-positive serum from patients. These results indicated that the synthetic multiepitope PCX3 antigen elicits a potent humoral and cellular immune response against HCV.     

双表达载体研究GM—CSF对HCV C基因免疫应答的影响

目的 HCV C蛋白基因诱导的免疫应答较弱，因而增强HCV C蛋白基因免疫对于开发HCV疫苗具有要其的重要性。方法 将GM－CSF基因与pc154基因插入双表面载体pcDNA3.0 BA构建成双价质粒pcDNA3.0 APC154GM-CSF,肌肉免疫Balb/c小鼠。结果 GM－CSF和pc154在Cos-7细胞中同时获得瞬时表达；pcDNA3.0 BApc154GM-CSF双价质粒较单价pcDNA3.0 BApc154诱导小鼠产生抗体的几何平均滴度显著增高（P＝0.04），而pcDNA3.0 BApc154 pcDNA3.0 BAGMCSF混合质粒较单价质粒pcDNA3.0 BApc154诱导小鼠产生抗体的滴度极显著降低（P＜0.01）。HCV C蛋白抗原特异性的脾淋巴细胞增殖能力，双价质粒较单价及单价混合质粒极显著增高（P＜0.01）。结论 双表达载体同时输送GM－CSF与pc154基因能增强Balb/c小鼠对HCV C蛋白基因的体液免疫应答及免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力。     

轮状病毒VP7 DNA免疫研究

目的 研究促使基因分泌或膜锚定表达的基因修饰对轮状病毒VP7 DNA疫苗所诱导抗体水平的影响。方法 把携带野生型（VP7wt）、分泌型（VP7s）和膜锚定型（VP7tm）3种VP7基因的重组pcDNA3质粒分别免疫小鼠,用大肠杆菌表达的重组VP7抗原检测VP7特异的抗体反应,统计分析。结果 3种DNA疫苗均能诱导轮状病毒VP7特异的IgG抗体反应,但其抗体水平之间无显著性差异。结论 把轮状病毒VP7基因导入分泌或膜锚定表达途径不能增强其DNA疫苗抗体应答。     

Effective induction of type 1 cytotoxic T cell responses in mice with DNA vaccine encoding two hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte epitopes

The aims of this study were to explain whether a multiple cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitope-based anti-hepatitis C virus (HCV) DNA vaccine can induce specific CTL responses to each HCV CTL epitope independently and long-term CD8(+) T cell memory responses, and to determine the cytokine secretion pattern and subtype of epitope-specific cytotoxic T cells. A multi-CTL epitope gene, which consists of two epitopes of HCV (H-2(d)-restricted HCV core(133142) and E1(315322)), was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1. BALB/c mice (H-2(d) restricted) were vaccinated intramuscularly with this multi-CTL epitope-based DNA vaccine. The epitope-specific CTLs against target cells (P815,H-2(d) restricted) pulsed with various CTL epitope peptides were detected by lactate dehydrogenase release assay, and the precursor frequency of epitope-specific CTLs was determined by limiting dilution analysis. Cytokines (interleukin [IL]-2, IL-4, and interferon-) in culture supernatants were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The multi-CTL epitope-based DNA vaccine directed against two HCV CTL epitopes could induce specific CTL responses to each of the two CTL epitopes independently and long-term CD8(+) T cell memory responses. The epitope-specific cytotoxic T cells produced helper T cell type 1 cytokines. This work demonstrated that multiepitope DNA vaccination is a potential strategy to control HCV infection.     

丙型肝炎病毒核心基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答

为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响。本文将ＨＣＶ核心区基因定向克隆于质粒ｐｃＤＮＡ３巨细胞病毒启动子下游,构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ,将此疫苗通过多点肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠。结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗－ＨＣＶＩｇＧ阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时Ｔｈ１免疫应答相关的细胞因子ＩＬ－２及γ干扰素水平也明显高于对照组,其结果     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究

目的：构建抗原基因为SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoY）S蛋白C端片段基因的DNA疫苗，采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况。方法：将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫，定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平，流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化，免疫组化检测抗原表达分布，脾细胞增殖实验评价CTL效果。结果：疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体。随着时问的延续，抗体水平逐步升高，至30天后达到稳定，以CTL为主的CD8^＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著，引起强大的体液免疫和细胞免疫；疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达；而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论：以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。