从新生小鼠、大鼠及鸡胚背根神经节分离的细胞培养

为了研究神经生长因子(NGF)对背根神经背细胞培养的作用,我们建立了背根神经节分离细胞培养的方法。在培养过程中观察了新生小鼠、大鼠以及鸡胚背根神经节细胞的生长分化。结果表明:在节根节神经元体外培养的早期1～2天NGF为必需的营养因子,而培养后期则不为背根神经节细胞生长所必需,在无NGF的条件下背根神经节细胞能继续存活。     

游离NgR促进新生大鼠背根神经节突起体外生长

目的 观察生物合成的游离NgR对新生大鼠原代背根神经节(DRG)神经元突起生长的影响.方法 以ViraPowerTM慢病毒将NgR(310)ecto基因转染人培养的骨髓基质细胞,收集培养上清获得游离NgR.分离新生大鼠DRG神经元并分为两组,对照组直接将神经元种植到经含中枢神经系统(CNS)髓鞘蛋白包被的培养皿中培养;实验组先将骨髓基质细胞培养上清加入含CNS髓鞘蛋白的培养皿中,孵育4 h后再植入DRG神经元.两组细胞均在培养24 h后固定,进行βⅢ-tubulin免疫组织化学染色,图像观察神经元及其突起生长情况.结果 基因修饰的骨髓基质细胞,转染后48 h间接免疫荧光的方法检测可见胞浆内荧光表达.种植24 h后对照组DRG细胞很少有突起长出;而实验组DRG细胞中60%的神经元长出突起,且突起较长.结论 游离NgR能够竞争性结合脊髓损伤后局部分泌的轴突生长抑制因子,从而保护生理性NgR,可能是促轴突再生和脊髓功能恢复的一种新策略.     

地塞米松对大鼠背根神经节细胞ATP激活电流的快速抑制作用

目的探讨地塞米松对大鼠背根神经节(DRG)神经元ATP激活电流的快速调节作用及其相关信号机制。方法采用酶加机械法分离、培养大鼠DRG神经元,全细胞膜片钳法记录ATP激活电流及地塞米松对ATP激活电流的影响。结果细胞外给予ATP(100μmol/L)在大鼠DRG神经元可引起3种内向电流,即快速脱敏感反应电流(快反应电流)、慢速脱敏感反应电流(慢反应电流)及混合电流。预先给予地塞米松(0.01~10μmol/L)可剂量依赖性地抑制ATP快反应电流及混合电流中的快反应电流成分,而对慢反应电流及混合电流中的慢反应电流成分无明显影响。地塞米松对ATP激活电流的快速抑制作用可被糖皮质激素受体拮抗剂RU38486(10μmol/L)、蛋白激酶A抑制剂H-89(10μmol/L)阻断,而G蛋白激活抑制剂GDP-β-S(0.2mmol/L)、蛋白激酶C抑制剂Chelerythrine chloride(10μmol/L)对地塞米松的快速抑制作用无明显影响。结论地塞米松通过糖皮质激素受体激活细胞内PKA信号途径可选择性地抑制大鼠DRG神经元中由P2X3受体介导的ATP快反应电流,提示糖皮质激素可能通过非基因组作用影响初级感觉神经元的ATP/P2X3受体功能而参与痛觉的调制。     

新生大鼠皮质神经元的体外原代培养及鉴定

神经元体外原代培养是神经药理、神经元分化发育、神经再生、神经疾病发生机制等研究的重要手段.国内外有关神经元培养的研究较多,但关于皮质神经元体外培养的报道较少.传统方法取材多采用胎鼠,但因其不易取材,且胎龄不易掌握,故目前以新生鼠取代胎鼠进行原代神经元培养已逐渐被接受.我们在参考既往培养方法的基础上,建立了一种简便、可行的新生大鼠皮质神经细胞原代培养模型,现报道如下.     

神经节苷脂对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用

目的 通过观察单唾液酸四己糖神经节苷脂( monosialotetrahexosyl gangliosides,GM-1)对大鼠脊髓损伤后微管相关蛋白-2（microtubule - associated protein 2,MAP -2）和胆碱乙酰转移酶( choline acetyhransterase,ChAT)的表达及运动功能的影响,探讨GM -1对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用及其机制。方法 Wistar雌性大鼠66只（体重260～ 300 g）,随机取6只作为正常对照组,余60只采用改良Allen打击法于Tt0节段制作大鼠急性脊髓损伤模型,并按随机数字表法分为GM -1组（A组）和等渗盐水对照组（B组）,每组30只大鼠。分别于术后1,3,7,14和28 d采用改良Tarlov评分法评价大鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复程度后处死取材,每组各时相点6只大鼠。以免疫荧光染色观察大鼠脊髓损伤后MAP -2和ChAT的表达情况。结果 术后7d起,Tarlov评分在A、B组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),即A组大鼠运动功能恢复优于B组。免疫荧光染色发现,A组术后各时相点MAP -2及ChAT呈阳性表达的细胞数量较B组同时相点明显增多（P＜0.05）。结论 脊髓损伤后大鼠神经功能的恢复与MAP -2及ChAT的表达呈一定的相关性;GM -1可通过增强脊髓损伤后MAP -2及ChAT的表达来保护神经元。     

模拟失重对雌性大鼠背根神经节的影响

 目的 观察模拟失重对雌性大鼠背根神经节(dorsal rootganglion, DRG)的影响。方法 选取健康雌性大鼠80只,随机分为尾部悬吊实验组(n=40)和正常对照组(n=40)。实验组按照Morey-Holton教授提出的方法保持-30°头低位及后肢自由悬垂不负重的状态,各组大鼠按标准条件进行饲养。4周后取右侧L₅ DRG,HE染色观测DRG细胞形态,免疫组化观测髓鞘情况,电镜观测DRG髓鞘及线粒体超微结构。结果 HE染色结果显示,与对照组相比,实验组DRG细胞间隙轻度增宽,部分节细胞与卫星细胞分离。免疫组化结果显示,对照组免疫组化染色及IOD值(0.573±0.007)较实验组IOD值(0.802±0.009)降低(P<0.05),电镜下可见实验组髓鞘结构紊乱、松散,线粒体肿大、变形。结论 模拟失重可引起雌性大鼠DRG髓鞘及线粒体发生损伤性变化,推测模拟失重下可导致雌性大鼠DRG损伤。     

晶体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用

目的　研究晶体蛋白能否促进离体培养的视网膜神经节细胞 (RGCs)存活和生长,初步探讨损伤晶状体促进RGCs的存活和轴突再生的确切作用物质。　方法　分别用晶体蛋白、晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行培养,观察RGCs在体外存活时间,测量培养 1, 3, 5d有突起RGCs数、最长突起长度及细胞活性,进行组间比较。　结果　 (1)晶体蛋白组细胞能存活 12~14d,较其他两组显著延长 (P<0. 05 )。 ( 2 )培养 1, 3, 5d,各实验组有突起的RGCs数均明显多于对照组(P<0. 01),晶体蛋白组有突起的RGCs数较其激活的巨噬细胞培养液组明显增多(P<0. 01)。(3)培养 1, 3, 5d,各实验组RGCs最长突起长度均较对照组显著延长 (P<0. 01),且晶体蛋白组与其激活的巨噬细胞培养液组比较,差异有统计学意义 (P<0. 01)。(4)培养 3d和 5d时,晶体蛋白组细胞活性显著高于对照组 (P<0. 01)。　结论　(1)晶体蛋白对离体培养的RGCs存活和生长具有显著的直接促进作用; (2)晶体蛋白也可通过激活巨噬细胞间接发挥作用,但以直接作用为主。     

大鼠骨癌痛模型的制备及电压依赖性钠通道Nav1.8在其背根神经节的表达研究

目的 建立大鼠骨癌痛模型并观察电压依赖性钠通道Nav1.8在其背根神经节(DRG)的表达,以探讨Nav1.8在癌症性疼痛中的作用.方法 在雌性SD大鼠左胫骨内注射Walker256细胞(103/μl、104/μl、105/μl)后1、3、5、7、10、14天观察机械痛敏阈值和CO2激光热痛敏阈值的变化,与对照组大鼠进行比较,分析癌痛组大鼠出现痛阈降低的时间.于接种细胞后14天取双侧胫骨做病理切片观察肿瘤生长情况.RT-PCR检测癌痛组及对照组大鼠L5～L6DRG Nav1.8基因的表达.结果 所有接种Walker256细胞的大鼠均可见胫骨内实质性肿瘤的膨胀性生长和严重的骨质重构.各癌痛组大鼠分别于第7～14天出现进行性加重的疼痛行为学改变,其左侧(癌痛侧)DRG Nav1.8的表达明显升高(P＜0.05),对侧的表达与对照组之间无明显差异.结论 胫骨内注射Walker256细胞的大鼠在产生浸润性生长的骨肿瘤同时,可伴进行性的痛觉过敏,是骨转移瘤相关疼痛研究可靠的动物模型.Nav1.8基因在骨癌痛模型大鼠DRG中的表达水平上调,提示该通道可能参与骨癌痛的发生过程.     

神经节苷脂对大鼠脊髓损伤诱导的自噬性神经元死亡的影响

目的 探讨神经节苷脂(monosialotetrahexosy-1 ganglioside,GM1)对脊髓损伤诱导的神经元自噬性死亡的影响. 方法 90只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、等渗盐水组和GM1组,每组30只.等渗盐水组和GM1组采用Allen法建立T10脊髓损伤动物模型,荧光显微镜下观察内源性细胞自噬相关蛋白(LC3)的表达;Western印迹法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、细胞蛋白(Beclin-1)表达. 结果 与假手术组比较,等渗盐水组LC3表达水平明显上调(P＜0.05):与等渗盐水组比较,GM1组LC3表达水平明显下调,自噬体形成明显减少(P＜0.05).与假手术组比较,等渗盐水组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显上调(P＜0.05);与等渗盐水组比较,GM1组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显下调(P＜0.05). 结论 GM1通过抑制脊髓损伤后自噬性细胞死亡,起到保护神经元作用.     

体外培养大鼠胚胎脊髓神经元损伤前后的凋亡变化

目的研究体外培养脊髓神经元损伤前后的凋亡变化,进一步探讨中枢神经损伤的分子机制。方法取孕14天的Wistar大鼠脊髓神经元进行培养,划痕损伤神经元突起,对神经元损伤前后的凋亡变化进行观察。结果损伤前后体外培养脊髓神经元凋亡数量有明显差异,损伤前几乎未见凋亡的神经元,损伤后1天凋亡神经元最多,损伤后3天凋亡神经元也明显增多,损伤后5天凋亡神经元呈明显下降的趋势,损伤后7天凋亡神经元又开始增多。结论了解体外培养脊髓神经元损伤前后细胞凋的规律,为脊髓神经元损伤后给予干预措施的实验研究奠定了基础。     

背根神经节端侧吻合延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

 目的 建立背根神经节端侧吻合营养失神经腓肠肌的动物模型,观察其延缓失神经骨骼肌萎缩的作用.方法 选用48只SD大鼠,随机分成两组,实验组:腓肠肌失神经支配加背根神经节端侧吻合;对照组:腓肠肌单纯完全失神经支配.于术后4、8、12周各时间段,分别测定腓肠肌纤颤电位波幅、肌湿重、肌细胞直径及截面积,并观察背根神经节中感觉神经元的变化,判断肌萎缩的程度.结果 术后1～3个月背根神经节中均见到存活的感觉神经元,纤颤电位波幅实验组大于对照组;术后4、8、12周,实验组的肌湿重,肌细胞直径及截面积明显高于对照组.结论 周围神经损伤后的3个月内,背根神经节端侧吻合后感觉神经元能有效的延缓失神经骨骼肌萎缩.     

逼尿肌细胞的原代培养和鉴定

目的建立逼尿肌细胞的原代培养及鉴定方法。方法应用Ⅱ型胶原酶消化分离逼尿肌细胞,在含20%胎牛血清DMEM培养液中培养,观察细胞形态和扩增情况,用a-SM-Actin进行免疫组化鉴定细胞类型。结果 逼尿肌细胞在培养18 h后开始贴壁在瓶底,4~5 d后可见细胞融合,8~10 d后可见细胞覆盖瓶底80%以上。a-SM-Actin免疫组化染色鉴定,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物。结论该方法简单、易于掌握,短期内可获得大量高纯度的逼尿肌细胞。     

组织工程延长后根神经节细胞移植修复脊髓损伤大鼠的长期存活观察

 目的 探索采用组织工程技术,构建由活性轴突形成的较长神经组织移植物,用来修复脊髓损伤.方法 (1)移植物制备:从8~10个15 d胚胎鼠取脊髓后根神经节(doral root ganglion,DRG)细胞,在普通神经细胞培养环境中培养5 d,然后用特制的延长装置将神经节细胞机械拉长,1 mm/d, 2 d,然后增至2 mm/d, 3 d,再减至1 mm/d, 2 d,培养获得10 mm长轴突105~106根,用水凝胶包裹构成神经组织准备移植,移植前用BDA标记轴突及其细胞体.(2)动物模型:成年雌性Sprague-Dawley大鼠225~250 g,40 mg/kg苯巴比妥腹腔注射麻醉,行T9~11双开门手术切除该节段右侧半脊髓约10 mm,同时移植构建好的移植物或单纯移植水凝胶为对照,严密缝合硬膜后行扩大椎板成形术,2个月后处死取标本.(3)免疫组化:纵向连续冷冻切片20 μm/张,行anti-NF200、anti-CGRP(DRG特异)、anti-BDA免疫组化染色.结果 2个月后单纯移植水凝胶者,没有宿主轴突长入水凝胶.移植DRG者,anti-NF200、anti-CGRP、anti-BDA染色均证实2个月后移植细胞存活.结论 组织工程延长后根神经节细胞移植物可以存活达2个月,或有可能在较长的脊髓损伤部位建立上下联系.     

大鼠周围神经损伤后感觉神经元死亡性质的探讨

目的 :研究周围神经损伤后 ,脊神经节感觉神经元的死亡性质。方法 :切断并原位吻合一侧大鼠坐骨神经 ,对侧不作任何处理、作为对照 ,于术后不同时间取L4～L6脊神经节作光镜和电镜染色观察脊神经节感觉神经元胞体形态的变化。结果 :光镜下 ,损伤的脊神经节感觉神经元胞体染色质浓染 ;电镜下 ,细胞膜内陷分割细胞内容物成凋亡小体 ;而对侧脊神经节感觉经元胞体均一、无变化。结论 :大鼠坐骨神经损伤后 ,脊神经节感觉神经元的死亡主要形式是细胞凋亡     

大鼠周围神经损伤后感觉神经元死亡数量的研究

目的 :研究周围神经损伤后 ,脊神经节感觉神经元的死亡数量。方法 :先计算正常SD大鼠两侧的脊神经节感觉神经元胞体数是否对称 ,再切断并原位吻合右侧大鼠坐骨神经 ,左侧不作任何处理、作为对照 ,于术后不同时间取L4～L6脊神经节作HE染色计算脊神经节感觉神经元胞体数量的变化。结果 :正常SD大鼠两侧的脊神经节感觉神经元胞体数量呈对称分布 ;右侧坐骨神经损伤后 ,其脊神经节感觉神经元胞体数量较左侧减少。结论 :大鼠坐骨神经损伤后 ,脊神经节感觉神经元的胞体有死亡 ,其死亡具有一定的特征。     

兔肌腱细胞原代培养方法研究

 目的 探索兔肌腱细胞的培养方法,为临床人工肌腱等组织工程研究提供理论依据.方法 用消化贴块法培养兔体肌腱细胞,用倒差显微镜及共聚焦显微镜观察细胞生长及形态特征.结果 兔肌腱细胞在体外呈长梭形,胞质均匀透明,细胞核均匀,汇合后呈平行致密排列并有层叠等特征,传代后生长特征仍保持稳定.结论 本实验成功培养了兔肌腱细胞,为肌腱组织工程学种子细胞的来源研究提供了一定的借鉴.     

人微血管内皮细胞通过分泌神经生长因子促进背根神经节细胞增殖机制研究

目的探讨神经生长因子(NGF)在人微血管内皮细胞(HMVEC)促进背根神经节细胞(DRGC)增殖中的作用及分子机制。方法分离培养小鼠DRGC细胞,通过Transwell共培养小室与HMVEC进行非接触共培养,实验设HMVEC单独培养组、DRGC单独培养组、HMVEC与DRGC共培养组及PD90780组。PD90780组HMVEC使用NGF拮抗剂PD90780预处理1 h后,再与DRGC共培养。ELISA检测细胞上清液中NGF的水平;倒置显微镜观察各组DRGC生长情况;MTT检测细胞增殖水平;Real-time PCR检测GAP-43 mRNA水平;免疫荧光检测GAP-43水平;Western blot检测各组DRGC细胞中Ki-67、PCNA、GAP-43、ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达。结果 HMVEC与DRGC共培养明显上调NGF水平。与DRGC单独培养组比较,HMVEC与DRGC共培养显著提高DRGC细胞增殖水平及增殖相关蛋白Ki-67、PCNA的表达,GAP-43 mRNA及蛋白水平均显著上调,ERK、AKT信号通路活化明显增加;与共培养组比较,PD90780处理组DRGC细胞增殖水平明显下降,Ki-67、PCNA、GAP43表达水平下调,ERK及AKT信号通路活化受到抑制。结论 HMVEC通过分泌NGF发挥促进DRGC增殖的作用,NGF拮抗剂能够逆转HMVEC对DRGC细胞增殖的影响。