乙型肝炎病毒X抗原转导细胞差示表达全长基因C2的克隆及初步功能研究

目的　克隆乙型肝炎病毒X抗原 (HBxAg)相关肝癌差示表达基因并做功能研究。方法　 (1)用逆转录病毒方法建立表达HBxAg细胞模型。 (2 )用抑制差减杂交做基因差示表达分析。 (3)做RNA印迹分析 (NorthernBlot)及原位分子杂交筛选基因探针。 (4 )用 5′和 3′迅速末端扩增法 (RACEPCR)进行全长基因序列扩增 ,并进行体外蛋白翻译及制备抗体 ,做蛋白质印迹 (WesternBlot)分析。(5 )进行该基因细胞内转导 ,进行功能研究。结果　共得到 10个cDNA探针 ,其中 8个因HBX表达上调 ,2个表达下降。经筛选及全长基因扩增 ,得到 1个全长为 1.35kb、编码 113个氨基酸的全长基因C2 ,和蛋白翻译起始因子 (Suil)同源 ,其表达被HBX抑制。初步功能研究显示 ,此基因对细胞生长具有抑制作用 ,并且正常肝组织中其mRNA信号明显高于肝癌组织。结论　我们不仅克隆出HBX相关基因C2并进行了功能研究 ,还首次提出DNA病毒 (HBV)能通过对细胞蛋白翻译水平的调节而导致癌变的机理     

PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

VEGF111b的表达载体构建及抗体制备

目的克隆VEGF111b基因,构建真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,并进行测序,制备VEGF111b多克隆抗体。方法丝裂霉素C诱导处理卵巢癌SKOV3细胞24 h,设计VEGF111b酶切引物,以SKOV3细胞的c DNA为模板,通过PCR得到VEGF111b特异性基因产物,克隆入真核表达载体pc DNA3.1中,获得重组真核表达载体pc DNA3.1-VEGF111b,测序验证。用KLH耦联VEGF111b特异性短肽,制备多克隆抗体,Western blot检测其特异性。结果成功扩增了VEGF111b基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pc DNA3.1中,测序结果与预测完全一致,成功制备了VEGF111b多克隆抗体,使用其多克隆抗体,Western blot能够检测到VEGF111b对应分子量的蛋白条带。结论本研究鉴定了pc DNA3.1-VEGF111b真核表达载体,并验证了VEGF111b多克隆抗体的特异性,为进一步研究VEGF111b蛋白的功能奠定了基础。     

重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.     

幽门螺杆菌hp1188基因的原核表达

目的:重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究该基因所编码蛋白在H.pylori的黏附过程中的作用奠定基础.方法:以H.pylori标准株NCTC 11637基因组DNA为模板,PCR扩增hp1188基因片段,克隆至质粒pQE-30中获得重组质粒pQE30-hp1188,经DNA测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α,IPTG诱导表达.Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测表达,Western blot鉴定相应抗原表位.结果:扩增的hp1188基因片段全长810 bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%.SDS-PAGE显示表达产物相对分子量约为30 600 Dalton,与预期相符;大肠杆菌裂解液中表达产物接近可溶性蛋白总量的一半,但沉淀中仍能检测到表达蛋白.目标蛋白纯化后均一性接近90%,Western blot证实与多克隆抗体有良好结合能力.结论:成功克隆了hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1亚基，制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板，设计引物，将聚合酶链反应（PCR）扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中，1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱亲和纯化，用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白，用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术（Western blot）分析，证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达，为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。     

小鼠TLR-2N末端基因的克隆表达和抗体制备

目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1～153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.     

抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

目的 克隆PAK5-N端基因并诱导其表达,进行多克隆抗体制备,为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法 根据人全长PAK5 cDNA序列．设计引物;利用PCR技术．以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因,将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中,经EcoRI／XhoI双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论 成功克隆了PAK5-N端基因．在E-coli中表达了PAK5-NT,并纯化了GST融合蛋白,制备了PAK5特异性抗体。Western blotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达,为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

A novel full-length gene of human ribosomal protein L14.22 related to human glioma

Background This study was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma by cDNA microarray and the characterization of a novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma and normal brain tissues, and mRNA was used as a probe. The results of hybridization procedure were scanned with the computer system. The gene named 507E08 clone was subsequently analyzed by northern blot, bioinformatic approach, and protein expression. Results Fifteen differentially expressed genes were obtained from human glioma by hybridization and scanning for four times. Northern blot analysis confirmed that the 507E08 clone was low expressed in human brain tissue and over expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that the 507E08 clone was a novel full-length gene, which codes 203 amino acid of protein and is called human ribosomal protein 14.22 gene. The nucleotide sequence had been submitted to the GenBank?with the accession number of AF329277. After expression in E.coli., protein yielded a major band of apparent molecular mass 22 kDa on an SDS-PAGE gel. Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human ribosomal protein 14.22 may be correlated with the development of human glioma.     

肝癌内高表达新基因的部分cDNA克隆

目的寻找人肝癌相关的基因。方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，对表达序列标记（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅ－ｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ，ＥＳＴ）基因克隆进行筛选，以得到的基因片段为探针，筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。结果得到一个在肝癌内高表达的ＥＳＴ基因片段。进一步筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库，得到一命名为ＦＬ６的ｃＤ－ＮＡ克隆，核苷酸序列测定表明，ＦＬ６长度为１４６４个碱基，检索最新版本ＧｅｎｅＤａｔａｂａｓｅｓ（ＥＭＢＬ９６．６），未发现同源基因。实验结果还显示该基因在胎儿各组织内有不同的表达特性。结论该基因可能与细胞的增殖、癌变过程相关。     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

大鼠部分肝切除后再生肝组织中上调表达基因的克隆与分析

目的克隆肝再生中差异表达的基因,为最终阐明肝再生的调控机制奠定基础。方法采用大鼠短间隔连续肝切除(SISPH)模型,用抑制性消减杂交技术(SSH)研究4～8h之间差异表达的基因。结果用SSH分析0、4h、8h和12h模型的4～8h再生肝,筛选出33个与肝再生有关的上调表达序列标记(EST),其中17个为已在肝再生中报道的已知基因,6个为首次报道的已知基因,10个为大鼠中尚未报道的新基因,并对新基因在NCBI进行注册。结论在肝再生中SSH是一个分离肝再生差异表达基因的强有力工具,这些差异基因的分离,尤其是在肝再生中首次报道的已知基因和新基因的分离,可为进一步阐明肝再生的机制奠定基础。     

应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异性表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组。肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组,应用抑制消减杂交技术,构建实验组特异表达cDNA消减文件;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDPP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDPP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。     

肝癌相关基因HCCA2的克隆及其与肝癌的相关性研究

目的　研究和克隆新的肝癌相关基因,探索肝癌发生的分子基础。方法　采用mRNA差异显示技术,分析肝细胞癌和癌旁组织间基因的差异表达情况,获得差异表达基因片断。用此基因片断作为探针,通过筛选胎盘cDNA文库,以获得该基因cDNA全长,并用Northern印迹杂交的方法,分析所获得的新基因在43对肝细胞癌、对应癌旁组织中的差异表达和在正常组织中的分布。结果　克隆了一个新的肝癌相关基因HCCA2的全长cDNA,其在人体正常组织中分布较为广泛,在正常肝组织中不表达。该基因在43对肝癌组织中表达的阳性率是79%(34/43)。它的表达与肝癌包膜的完整性、Ki-67蛋白的表达相关（P<0.01）。结论　肝癌差异表达新基因HCCA2可能与肝癌细胞的浸润和增殖能力有关。     

应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因

目的　寻找斑秃脱发区毛乳头中特异表达的基因片段 ,探讨斑秃发病机制。方法　应用抑制性消减杂交构建斑秃脱发区毛乳头差异表达基因的cDNA文库 ,并通过PCR筛选、杂交验证和同源性检索对差异表达基因进行分析。结果　成功建立了高消减效率的斑秃脱发区毛乳头cDNA消减文库 ,并克隆到一条斑秃毛乳头特异表达的基因片段DP3( 3 0 7bp) ,应用cDNA斑点杂交及Northern杂交证实它仅在脱发区毛乳头特异表达 ,同源性检索其为一条甲状腺相关的自身抗原基因。结论　DP3在斑秃脱发区毛乳头的特异表达提示其可能参与斑秃的发病过程 ,它的克隆为斑秃发病机制的自身免疫学说进一步提供了实验依据     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的：发现并克隆缺血再灌可诱导基因,方法：应用mRNA差异显示技术,在猪的心肌组织,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段,随后筛选狸心脏cDNA文库,经克隆,测序,杂交后,分析克隆基因的基本特性,结果：发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段,通过筛选cDNA文库获得一个编码608个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因,蛋白质氨基酸均无同源性,Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高,并且在正常猪的心,肝,肺,肾,脾,肠,脑和骨骼肌组织均可检测到其表达,Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性,结论：克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的 :发现并克隆缺血再灌可诱导基因。方法 :应用mRNA差异显示技术 ,在猪的心肌组织 ,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段 ,随后筛选猪心脏cDNA文库。经克隆、测序、杂交后 ,分析克隆基因的基本特性。结果 :发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段 ,通过筛选cDNA文库获得一个编码 6 0 8个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因、蛋白质氨基酸均无同源性。Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高 ,并且在正常猪的心、肝、肺、肾、脾、肠、脑和骨骼肌组织均可检测到其表达。Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性。结论 :克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因 ,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。