人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库的构建

目的为进一步获得人卵巢癌相关抗原基因,构建人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库.方法从人上皮性卵巢癌组织提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400 bp片段,收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人卵巢癌组织cDNA表达文库.结果经检测该原始文库滴度为5.5×106 pfu/ml,扩增后文库滴度为3.0×1011 pfu/ml,重组率96%.插入片段平均大小1.0 kb以上.结论所构建的人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库质量合格,为以后筛选获取卵巢癌特异性相关抗原基因或其它相关基因奠定了基础.     

屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的构建屋尘螨cDNA表达文库. 方法用RNAiso Reagent试剂盒提取屋尘螨Total RNA,用Poly AT tract mRNA分离试剂盒提取mRNA,用Clontech公司SMARTTM PCR cDNA library kit反转录合成第1链cDNA,用LD-PCR合成第2链cDNA并扩增,PCR产物与MaxPlax TM试剂盒体外连接包装,建成未扩增的cDNA文库,计算其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度. 结果cDNA文库未扩增时滴度为9.148×106,重组效率达93.88%以上,文库扩增后滴度为7.628×109,插入片段平均1.63 kb. 结论成功地构建了高质量的屋尘螨cDNA表达文库.     

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库,为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)法反转录合成双链cDNA,以λTripIEX2为载体,构建铁皮石斛cDNA文库,文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位 (pfu)的数目来表示,PCR扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库,原始文库的噬菌斑滴度为 4．3×105pfu/mL,总克隆数为3．1×105,重组率为97．6％,扩增后文库总滴度为6．8×109 pfu／mL,对随机挑取的噬菌斑进行 PCR鉴定,结果插入片段多分布在0．5～2．0kb之间,绝大部分在1．2～1．7 kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明,所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24%,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02%;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36%,0.5～1 kb的占63.64%.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库     

卵巢上皮性癌相关抗原cDNA表达文库的构建

目的:构建人卵巢上皮性癌cDNA表达文库.方法:提取卵巢上皮性癌患者腹腔积液肿瘤细胞mRNA,反转录合成双链 cDNA,末端补平后连接EcoRI接头,末端磷酸化,XhoI消化,将双末端黏性化的双链cDNA经过凝胶层析柱,收集大于500 bp的cDNA片段,加工后与Uni-ZAP XR Vector连接,经过体外包装,感染宿主菌XL1-blue MRF′,构建cDNA文库,检测文库容量和质量.结果:cDNA表达文库原始库容为1.82×106,扩增后文库的库容为7.5×109,重组效率约为90%,插入片段大小主要集中在1.0～2.0 kb.结论:成功构建了一个卵巢上皮性癌cDNA表达文库,为下一步筛选、鉴定卵巢上皮性癌相关抗原奠定了基础.     

人源性大肠癌抗原基因噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法从人大肠癌组织中提取总RNA,用RT-PCR合成cDNA第1链,用LD-PCR合成cDNA第2链,除去小于500 bp的小片段,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成cDNA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,滴定文库的滴度,确定文库容量大小;用ITPG诱导和X-gal显色测定重组率;用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果构建成含2.39×106 pfu/ml重组噬菌体的人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,重组率为97.5%,插入cDNA片段大小范围从600~4 000 bp,平均长约1 400 bp。结论成功构建高质量人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因。     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

Construction and Significance of Directional Expression cDNA Library from Human NB4 Cells

Acutepromyeloidleukemia (APL)characterizedbythetranslocationt(15 ;17)isuniquelysensitivetothedifferentiation inducingeffectsofall trans retinoicacid (ATRA) .ATRAinducescompleteclinicalre missionsinmostofthepatientswithAPL .However ,chronicdailyoraladminis…     

常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)

目的　利用 RNA转录 5′末端转换机制 (SMART)构建适合免疫筛选的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库。方法　通过反转录 PCR和长距离 PCR获得常氏肝癌细胞的全长 c DNA,然后利用 SMART c DNA文库构建试剂盒建立经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞c DNA文库。结果　通过测定 ,高质量的包含常氏肝癌细胞全长 c DNA的 c DNA文库得到建立 ,扩增 c DNA文库的滴度高达 4.5× 10 10 pfu· ml- 1,重组子内平均插入外源基因片段长度在 2 0 0 bp到 40 0 0 bp之间 ,约 150 0 bp左右 ,并且此文库适合免疫筛选。结论　结果显示所构建的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库具有很高的质量 ,为进一步研究常氏肝癌细胞和筛选相关基因获得 c DNA全长奠定了坚实的基础