正常及退变髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向分化效果比较

目的:分离培养SD大鼠退变髓核细胞(degenerative nucleus pulposus cells,dNPCs)?正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)及骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),通过Transwell非直接接触体外共培养方法比较dNPCs和NPCs对BMSCs诱导作用?方法:针刺抽吸法制备SD大鼠退变椎间盘动物模型,取正常及已退变的生长良好的第2代NPCs及生长良好的第3代骨BMSCs,将dNPCs 或NPCs等比例与BMSCs分别复合藻酸盐接种于Transwell共培养系统中进行体外非接触共培养(上室接种BMSCs,下室接种dNPCs或NPCs作为dNPCs共培养组和NPCs共培养组)7 d后回收上室BMSCs?单独NPCs和单独BMSCs培养组分别作为阳性和阴性对照?对各组Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和多功能蛋白聚糖(aggrecan)行RT-PCR和Western blot检测?结果:collagen Ⅱ和aggrecan的mRNA表达在两共培养组均有较高表达,但NPCs共培养组较dNPCs共培养组更加接近单纯NPCs组,而单纯BMSCs组未见明显表达;collagenⅡ和aggrecan的蛋白表达量在两共培养组中均较高,但NPCs共培养组较dNPCs共培养组更加接近单纯NPCs组,而单纯BMSCs组未见明显表达?结论:在Transwell非直接接触共培养条件下dNPCs和NPCs均能诱导BMSCs向髓核方向分化,并且NPCs对BMSCs向髓核方向分化的诱导作用更加明显?     

人骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用

目的探讨人骨髓间充质干细胞分别与正常及退变髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用并进行比较。方法取来源于腰椎退变患者以及脊柱侧弯患者的间盘组织,通过改良Pfirrmann法对其退变程度进行分级,进行髓核细胞（NPCs）的分离培养及鉴定,通过术中椎弓根钉道取血,进行骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养及鉴定。取传至第3代细胞进行共培养。建立5个培养组：BMSCs单独培养组,退变NPCs单独培养组,正常NPCs单独培养组,BMSCs与退变NPCs共培养组,BMSCs与正常NPCs共培养组。共培养7d后,RT—PCR法检测各组细胞SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达。结果相较于BMSCs单独培养组,共培养组BMSCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均有明显增加（P〈0．05）。同时与BMSCs与正常NPCs共培养组相比,BMSCs与退变NPCs共培养组BMSCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均有明显增加（P〈0．05）。与退变NPCs单独培养组相比。共培养组退变NPCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均明显增加（P〈0．01）。与正常NPCs单独培养组相比,共培养组正常NPCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均明显增加（P〈0．01）。结论BMSCs与NPCs共培养时的相互作用能促使BMSCs向类髓核表型分化,较之正常NPCs,退变NPCs与BMSCs共培养时能更明显地促进BMSCs向类髓核表型分化。同时BMSCs对NPCs的调节作用能促进其特征性相关基因表达,与退变NPCs共培养时,这一效应依然明显。     

自体骨髓间充质干细胞复合髓核脱细胞基质修复椎间盘退变的实验研究

目的 探讨自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）辅以髓核脱细胞基质（DNPM）的细胞治疗作用。方法 在本研究中,我们制作了一种优化的DNPM并通过评估其生化组成、水含量、生物安全性和力学性能来评估其性能。进一步研究DNPM在体外对BMSCs的NP样分化的刺激作用,以及在体内动物模式下,对退变椎间盘髓核的再生作用。实验分组：（1）sham组：非椎间盘损伤组;（2）退变组：椎间盘退变造模后未处理;（3）BMSCs组：椎间盘退变单纯注射BMSCs;(4)复合组：椎间盘退变注射BMSCs复合DNPM。结果 4周后,约68%和43%的胶原蛋白和sGAG分别保留在NPCs中。NPCs也表现出与新鲜NP相似的力学性能。此外,NPCs具有生物相容性,能够诱导椎间盘退变（IVDD）中髓核样分化和细胞外基质（ECM）的合成。在体外实验中,12周后,复合组的椎间盘高度指数（DHI）（近81%）和MRI指数（349.05±38.48）显著高于造模组,接近sham组。NPCs还部分恢复了体内退化NP组织的ECM含量和结构。结论 自体BMSCs辅以DNPM具有良好的生物和力学性能,并具有促进退化NPCs再生的能力,对...     

GDF-5基因重组腺病毒修复人退变髓核细胞的实验研究

【摘要】 目的 探讨腺病毒介导的GDF 5基因对人退变髓核细胞外基质表达的影响,探求一种基因治疗新途径。方法 利用腺病毒载体将GDF 5基因导入退变髓核细胞,设置为空白对照组（Control组）、阴性对照组（GFP组）、实验组（GDF 5组）3组,并分为3、7、14、21天四个观察时间点,分别检测3组髓核细胞sGAG、Hyp的含量,免疫染色、Safranine O染色观察细胞外基质合成情况,Real time PCR检测Aggrecan、Collagen II mRNA表达水平。结果 GDF 5组髓核细胞sGAG/DNA、Hyp/DNA均在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）,而Control组与GFP组之间任意观察时间点比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;免疫染色、Safranine O染色结果显示GDF 5组髓核细胞的蛋白多糖、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖在14、21天均呈强阳性染色,Control组和GFP组呈弱阳性染色。Real time PCR结果显示GDF 5组Aggrecan、Collagen II mRNA的表达在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 腺病毒介导的GDF 5能明显促进人退变髓核细胞Aggrecan、Collagen II mRNA的表达,并增加蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成,对细胞外基质具有明确的修复作用,是一种有效的基因治疗新方法。     

EMILIN3基因促进人骨髓间充质干细胞增殖及向软骨细胞分化

目的 探讨EMILIN3基因对人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)增殖及向软骨细胞分化的影响.方法 构建EMILIN3腺病毒表达载体,细胞分成hMSCs、hMSCs+对照腺病毒、hMSCs+ EMILIN3腺病毒3组,MTT法检测细胞的增殖情况,Real-time PCR法检测上述细胞向软骨细胞诱导后CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9mRNA的表达.结果 hMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞增殖能力明显快于hMSCs+对照腺病毒组和hMSCs组(P＜0.05),hMSCs+对照腺病毒组与hMSCs组增殖能力相比有所降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).hMSCs+ EMILIN3 腺病毒组细胞中CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9 mRNA的相对表达量与hMSCs+对照腺病毒组、hMSCs组相比明显增加(P＜0.05,P＜0.01).hMSCs+对照病毒组与hMSCs组相比有所增加,但没有明显的趋势(P＞0.05).结论 EMILIN3促进hMSCs增殖,并且可以增加hMSCs向软骨细胞诱导分化.     

SOX9基因修饰骨髓间充质干细胞并诱导其向髓核样细胞分化的实验研究

目的探讨SOX9慢病毒载体感染兔骨髓间充质干细胞(MSC)并诱导其向髓核样细胞的分化。方法构建SOX9基因慢病毒载体并感染MSC,将MSC分为未转导组、空转导组及SOX9转导组。采用流式细胞仪检测MSC的感染率及凋亡率,MTT检测MSC的增殖情况,RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测MSC中SOX9、Ⅱ型胶原及Aggrecan在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建SOX9基因慢病毒载体并感染MSC,感染率为100%。慢病毒载体感染对3组MSC的增殖及凋亡无明显影响;感染2周后,SOX9转导组MSC中SOX9及Ⅱ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达均明显高于未转导组与空转导组(P<0.01),Aggrecan mRNA及蛋白仅在SOX9转导组MSC中表达;SOX9转导组MSC中Ⅱ型胶原及Aggrecan荧光染色呈阳性,而空转导组及未转导组MSC均呈阴性。结论 SOX9慢病毒载体感染的MSC可被诱导向髓核细胞分化。     

藻酸钠微球培养对兔髓核细胞生物学特性的影响

目的探讨藻酸钠微球培养对兔椎间盘髓核细胞（NPCs）体外生物学特性的影响。方法4月龄健康新西兰大耳白兔6只,取髓核细胞原代培养,传代后分为实验组（藻酸钠微球培养）和对照组（平面培养）,通过倒置相差显微镜对髓核细胞进行形态学观察,MTT法测定两组髓核细胞增殖情况,运用RT-PCR技术检测两组髓核细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果经过2周的培养,两组髓核细胞增殖率无明显差异;藻酸钠微球培养组在Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达上均高于平面培养组（P〈0.01或P〈0.05）。结论藻酸钠微球培养法能促进髓核细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,在维持其表型稳定方面优于平面培养法。     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

血红素氧合酶-1通过NF-κB信号通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

目的 探讨血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及机制.方法 采用免疫组化和Western blot检测正常(LVF组,标本来源于年轻的椎体骨折行手术治疗的患者)及退变(IDD组,标本来源于椎间盘退变性疾病行手术治疗的患者)人椎间盘髓核组织中HO-1和磷酸化的P65(p-P65)的表达差异;体外培养退变髓核细胞,通过IL-1β处理增加髓核细胞凋亡,再用载HO-1质粒的慢病毒及小干扰RNA处理髓核细胞后检测凋亡的变化;通过P65抑制剂PDTC抑制p-P65表达后检测髓核细胞凋亡的变化.结果 免疫组化结果显示,HO-1在IDD组中的阳性表达率为(18.58 ±0.59)％,明显低于LVF组(58.26 ±2.48)％ (P ＜0.05),而p-P65在IDD组中的阳性表达率为(40.27±2.03)％,明显高于LVF组(19.75±1.98)％ (P ＜0.05).IL-1β能增加退变髓核细胞的凋亡,同时引起p-P65表达增加,HO-1-siRNA抑制HO-1表达后可以进一步提高髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而过表达HO-1处理细胞后能够降低IL-1β引起的凋亡增加,同时降低p-P65表达(P＜0.05).使用P65抑制剂PDTC抑制髓核细胞P65信号通路后,髓核细胞凋亡率明显降低,此时沉默HO-1不能增加髓核细胞凋亡.结论 HO-1能够通过NF-κB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡.     

移植同种异体髓核细胞对兔椎间盘退变早期干预的实验研究

目的 在诱导椎间盘退变的早期移植同种异体兔髓核细胞（ NPC）,观察NPC对退变椎间盘的修复效果。方法 体外分离、培养NPC,并通过组织化学染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对其进行鉴定。采用穿刺抽吸法建立兔椎间盘退行性变模型,造模同期进行细胞移植治疗。将27只5月龄日本大耳白兔随机分为3组：正常对照组（n=9）、NPC移植组（NPC组,n=9）及DMEM培养基组（DMEM组,n=9）。每只实验动物的L3-4、L4-5和L5-6作为实验干预椎间盘。术后4、8、12周分别利用标准化T2加权像信号强度（%ST2WI）、病理组织学、退变分数、免疫组化染色、免疫荧光染色以及二型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（aggrecan）mRNA表达水平评价修复效果。结果 术后12周,DMEM组的%ST2WI值、CollagenⅡ和aggrecan 的mRNA表达量均明显低于其它两组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组和NPC组退变分数明显低于DMEM组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组、NPC组的Collagen Ⅱ免疫组化和aggrecan免疫荧光染色均显示强阳性,而DMEM组随着时间的推移阳性逐渐减弱。 结论 在退变早期移植同种异体的兔NPC能有效修复椎间盘组织的髓核退变。     

血管内皮生长因子与转化生长因子的协同作用诱导兔骨髓间充质干细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的协同作用对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及其可能机制.方法 将细胞分为4组:对照组、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-VEGF组、AAV-TGF-β1组和VEGF+ TGF-β1组.穿刺法抽取兔骨髓液,分离培养原代BMSCs,分别构建AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体转染BMSCs,Western blot检测各组细胞中VEGF、TGF-β1的蛋白表达.流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测髓核细胞标志SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达,以及P38MAPK信号通路相关蛋白P38、MAPKAPK2和HSP27的表达.加入P38MAPK的特异阻滞剂SB203580预处理BMSCs,检测VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖、凋亡、分化及相关蛋白表达的影响.结果 VEGF和TGF-β1可通过调节P38MAPK信号通路抑制BMSCs凋亡,促进BMSCs增殖,并向类髓核细胞分化,且在其协同作用下效果显著.抑制P38MAPK信号通路可反转VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖分化能力的促进作用.结论 VEGF和TGF-β1的协同作用能增强BMSCs增殖和分化的能力,提高胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的表达,从而促进退变椎间盘的修复和再生.     

转染BMP7基因对兔髓核细胞生物学行为的影响

目的观察转染重组BMP7腺病毒（Ad-BMP7）后,兔髓核细胞BMP7和Ⅱ型胶原的表达情况。方法⑴取20只新西兰大白兔,15只作为实验组,5只作为实验对照组。实验组椎间盘注射Ad-BMP7,实验对照组注射携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒（Ad-GFP）,另设空白对照组。⑵分别于注射后1、2、4周各处死5只实验组兔子,注射后1周处死全部实验对照组兔子。RT-PCR和免疫组织化学染色检测BMP7的表达情况,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达情况。结果⑴实验组的髓核细胞显示了BMP7染色阳性结果,1、2、4周组阳性染色率差异无统计学意义（P〉0.05）。⑵实验组的髓核组织间质Ⅱ型胶原呈阳性染色,1、2、4周的灰度值单因素方差分析,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;SNK两两比较,第1周与第2、第4周差异有统计学意义（P〈0.05）,第2、第4周间差别无统计学意义（P〉0.05）。结论Ad-BMP7转染兔髓核细胞后,能获得长期表达,并能促进Ⅱ型胶原合成。     

体外培养人退变髓核组织细胞的活力和表型变化

目的建立人退变髓核组织细胞体外培养体系,探索最佳培养条件,为髓核退变机制研究和组织工程研究筛选种子细胞。方法采用酶消化法分离人退变髓核组织细胞,进行单层培养,通过CellCountingKit-8评估细胞活性,采用免疫细胞化学染色等方法比较不同代次细胞形态结构及软骨样表型和增殖活性。结果成功进行细胞单层培养和鉴定,P1～P3代细胞活性和Ⅱ型胶原的表达有明显降低（P〈0.05）。结论 P1、P2和P3代细胞表型保持符合软骨样细胞特征,能够为髓核退变体外研究和组织工程研究提供种子细胞。     

白细胞介素-1β诱导人椎间盘髓核细胞凋亡

目的：探讨人正常椎间盘髓核细胞的培养方法以及白细胞介素-1β（IL-1β）对人椎间盘髓核细胞凋亡的作用。方法：取特发性脊柱侧弯患者腰椎间盘髓核组织,用胰酶、胶原酶序贯消化法消化细胞,并用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化分别检测糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达,分别用20μg/L和200μg/L重组人IL-1β刺激髓核细胞24 h,检测其凋亡率。结果：用酶消化法可成功分离培养人椎间盘髓核细胞,检测所培养细胞可表达糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原,IL-1β20μg/L组中细胞凋亡率（8.46%）和IL-1β200μg/L组（19.00%）分别为空白对照组（2.86%）的2.95倍和6.63倍（P〈0.05）,IL-1β200μg/L组是IL-1β20μg/L组的2.24倍（P〈0.05）。结论：用酶消化法可成功培养人椎间盘髓核细胞,IL-1β可以诱导椎间盘髓核细胞凋亡,并且随着浓度升高凋亡率增加,提示炎症因子IL-1β在退变椎间盘细胞凋亡中起了重要的作用。     

BMP-7与IL-6对人髓核细胞ColⅡ与TIMP-1基因表达的影响

目的探讨不同浓度BMP-7与IL-6作用于体外培养的人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因表达的影响。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）半定量检测不同浓度BMP-7与IL-6作用下体外培养的人髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因的表达量。结果IL-6可以下调Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达;低浓度的BMP-7可以抵消相同浓度IL-6对髓核细胞的保护作用,高浓度的BMP-7可以促进Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达。结论BMP-7可以对抗IL-6作用和正向调节椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因及TIMP-1基因表达,提示BMP-7在临床治疗中可能具有逆转早期椎间盘退变的作用。     

旋转式生物反应器内构建组织工程髓核

目的 探讨旋转式生物反应器(RCCS)对体外构建的组织工程髓核的影响.方法 将兔髓核细胞体外扩增至第3代,以3×107/ml的浓度接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)无纺网支架上.实验组在RCCS内培养,对照组静态培养.培养4周后取出细胞与支架复合物,行大体标本观察、扫描电镜、组织学和免疫组织化学染色观察、定量测定糖胺聚糖(GAG)及DNA含量.结果 旋转式生物反应器下构建的组织工程髓核的厚度、大小及组织弹性好于对照组,实验组GAG、DNA含量分别为(211.0±10.9,13.3±2.1),Ⅱ型胶原免疫组织化学染色面积百分比明显高于对照组(152.0±14.4,7.5±1.5),差异有统计学意义(P<0.05).结论 旋转式生物反应器能促进椎间盘髓核细胞Ⅱ胶原及糖胺聚糖的合成分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.     

In vitro chondrogenesis of the goat bone marrow mesenchymal stem cells directed by chondrocytes in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system

Background  Cartilage injury has a very poor capacity for intrinsic regeneration. The cell-based treatment strategy for the cartilage repair using differentiated bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is, however, a promising approach to the chondral repair. This study was aimed to explore the chondrogenic potential of the goat BMSCs in the Transwell co-culture system and the poly-laetide-co-glycolide (PLGA) scaffolds.

Methods  The BMSCs were isolated from the goat iliac crest while the chondrocytes were obtained from the goat’s last costal cartilage. In the Transwell co-culture system, the BMSCs co-cultured with chondrocytes were designed as group A, whereas the goat’s BMSCs induced with the chondrogenic medium were group B. Both groups A and B were the experimental groups, while group C that only contained BMSCs was the control group. In the PLGA scaffolds co-culture system, BMSCs were seeded into the PLGA scaffolds, which were suspended in the 24-well plate, and the control group was established by presence or absence of chondrocytes at the bottom of the 24-well plate. Toluidine blue staining, Alcian blue staining, collagen II immunofluoresence, collagen II immunochemical staining, collagen I, collagen II, COL2a Q-PCR and osteopontin Q-PCR were used to examine the chondrogenic conditions as well as the expressions of chondrogenic and osteogenic genes.

Results  Cells isolated from the aspirates of the goat bone marrow proliferated rapidly and gained characteristics of stem cells in Passage 4. However, the differentiations of chondrocytes were not apparent in Passage 3. The results from Toluidine blue staining, collagen II immunofluoresence and PCR showed the transformation of BMSCs to chondrocytes in the Transwell co-culture system and PLGA scaffolds. Although the cartilage gene expressions were upgraded in both chondrogenesis group and co-culture system, the osteopontin gene expression, which represents osteogenic level, was also up-regulated.

Conclusions  The Transwell co-culture system and the PLGA scaffolds co-culture system can promote the chondrogenic differentiation of the goat’s BMSCs, while up-regulated osteopontin gene expression in the Transwell co-culture system implies the osteogenic potential of BMSCs.