miR-23b-3p在结直肠癌中的表达及其靶向KLF3抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的机制研究

目的:研究miR-23b-3p在结直肠癌中的表达情况及对结直肠癌SW620细胞侵袭和迁移的影响机制。方法:收集2018年01月至2020年12月我院胃肠外科手术切除的58例结直肠癌组织及癌旁组织标本,以及结直肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、HT-29、Lovo和人正常结直肠黏膜细胞FHC,采用qPCR法检测miR-23b-3p和KLF3相对表达水平。采用脂质体转染技术将miR-23b-3p mimics、mimics-NC转染至SW620细胞,采用Transwell实验和划痕实验检测其侵袭和迁移能力的改变。利用生物信息学软件预测并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p和KLF3的结合位点。将KLF3过表达质粒（pcDNA3.1-KLF3）或空载质粒（Vector）单独或联合miR-23b-3p mimics转染至SW620细胞,采用Transwell实验和划痕实验检测其侵袭和迁移能力的改变,采用qPCR和Western Blot实验检测SW620细胞中KLF3 mRNA及蛋白的表达。结果:miR-23b-3p在结直肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.05）,并与患者TNM分期和远处转移有关（均P＜0.05）;miR-23b-3p在结肠癌细胞系中的表达水平均显著低于FHC细胞,上调miR-23b-3p表达能显著抑制SW620细胞的侵袭和迁移能力。KLF3在结直肠癌组织和细胞中高表达,与miR-23b-3p在结直肠癌组织中的表达呈负相关（r=-0.326,P=0.013）,双荧光素酶报告基因实验证实miR-23b-3p直接靶向调节KLF3的表达, KLF3过表达能促进SW620细胞的侵袭和迁移,同时转染miR-23b-3p mimics可下调KLF3蛋白和mRNA表达,逆转KLF3过表达对SW620细胞侵袭和迁移能力的促进作用。结论:miR-23b-3p在结直肠癌中低表达并与肿瘤患者TNM分期及远处转移相关,miR-23b-3p靶向调控KLF3表达抑制结直肠癌SW620细胞的侵袭和迁移能力。     

lncRNA LINC00909靶向miR-548-3p对结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的 探讨lncRNA LINC00909是否通过靶向miR-548-3p而影响结直肠癌细胞放射敏感性。方法 采用qRT-PCR检测结直肠癌组织、癌旁组织中LINC00909、miR-584-3p的表达量;体外培养结直肠癌细胞SW480、SW620,分别将si-NC、si-LINC00909、miR-NC、miR-584-3p mimics、si-LINC00909与anti-miR-NC、si-LINC00909与anti-miR-584-3p转染至SW480、SW620细胞,用4 Gy照射细胞;克隆形成实验检测细胞存活分数及放射增敏比;MTT检测细胞增殖;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验验证LINC00909、miR-584-3p的靶向关系。裸鼠皮下移植瘤实验检测干扰LINC00909表达或抑制miR-584-3p表达对照射后移植瘤重量的影响。结果 结直肠癌组织中LINC00909的表达水平显著升高(P<0.05),miR-584-3p的表达水平显著降低(P<0.05);干扰LINC00909表达或miR-584-3p过表达后细胞存活分数明显降低(P<0.05),放射增敏比分别为2.017、1.762,并可抑制增殖、迁移及侵袭(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实LINC00909可靶向结合miR-584-3p;干扰LINC00909表达后移植瘤重量显著降低(P<0.05)。共转染anti-miR-584-3p后移植瘤重量显著升高(P<0.05)。结论 干扰LINC00909表达可通过上调miR-548-3p的表达而减弱结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力从而增强细胞放射敏感性。     

miRNA-541-5p负调控细胞周期蛋白D1抑制结肠癌细胞增殖和迁移的相关研究

目的:探讨miRNA-541-5p（miR-541-5p）负调控细胞周期蛋白D1（CCND1）对结肠癌细胞增殖和迁移的影响及其相关机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-541-5p在结肠癌细胞株HT29、SW480、SW620、HCT116和正常人肠上皮细胞株HIEC以及2017年4月至...     

miR-145-5p靶向TAGLN2调控结直肠癌SW620细胞侵袭和迁移的机制探讨

目的:探究微小RNA-145-5p（miR-145-5p）在结直肠癌组织和细胞中的表达情况及其靶向调控肌动蛋白凝胶蛋白2（TAGLN2）对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法:采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对48例结直肠癌患者癌组织、配对癌旁组织、结直肠癌细胞株（HCT8、SW620、HCT116、HT-29）及结直肠黏膜细胞FHC中的miR-145-5p和TAGLN2 mRNA表达进行定量分析。将SW620细胞设为空白对照组、miR-145-5p mimics组、mimics-NC组、pcDNA3.1-TAGLN2组、pcDNA3.1-Vector组和miR-145-5p mimics+pcDNA3.1-TAGLN2组,采用qPCR检测miR-145-5p和TAGLN2 mRNA表达,采用Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力,采用免疫印迹法（Western blot）检测TAGLN2蛋白及EMT相关蛋白表达,采用双荧光素酶报告实验检测miR-145-5p和TAGLN2间的靶向关系。结果:miR-145-5p在结直肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.05）,并与结直肠癌患者的TNM分期和淋巴结转移相关（均P<0.05）;TAGLN2在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,并与miR-145-5p表达呈负相关（P<0.05）;miR-145-5p和TAGLN2在结直肠癌HCT8、SW620、HCT116和HT-29细胞中的表达水平显著低于或高于FHC细胞（均P<0.05）。miR-145-5p过表达可降低SW620细胞的侵袭和迁移能力。miR-145-5p靶向调控TAGLN2表达,单独转染TAGLN2阳性质粒可增加SW620细胞的侵袭和迁移能力,与miR-145-5p mimics同时转染后,TAGLN2蛋白、波形蛋白（Vimentin）和神经钙黏素（N-cadherin）表达降低,上皮钙黏素（E-cadherin）表达升高,TAGLN2对SW620细胞侵袭和迁移能力的增强作用被显著抑制。结论:miR-145-5p在结直肠癌中呈低表达状态,其表达水平与结直肠癌患者的TNM分期和淋巴结转移密切相关,miR-145-5p靶向调控TAGLN2抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力。     

微小RNA-199b-3p靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-199b-3p（miR-199b-3p）靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响。方法 采用Lipofectamine脂质体法将miR-199b-3p抑制剂及阴性对照（NC）转染至SW620细胞并分为抑制剂组和NC组,同时以未转染的SW620细胞作对照。采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测3组miR-199b-3p的表达以评价转染效果,MTT法和Annexin Ⅴ-FITC／PI流式细胞术检测转染后的增殖活性及凋亡率,QPCR和Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及SOX6的mRNA和蛋白水平,构建含有野生型及突变型SOX6-3’UTR的荧光报告基因质粒并采用双荧光素酶报告实验验证miR-199b-3p对SOX6的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,转染48 h后抑制剂组的miR-199b-3p的表达水平为0.526±0.034,低于未转染组的1.009±0.064和NC组的0.960±0.057,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制剂组转染24、48、72 h后的SW620细胞的增殖活性均降低（P＜0.05）;抑制剂组的凋亡率为（37.533±1.459）％,高于未转染组的（6.101±0.663）％和NC组的（8.753±1.061）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制剂组SW620细胞的SOX6、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均高于未转染组和NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明 miR-199b-3p可显著抑制野生型 SOX6-3’UTR的荧光荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论miR-199b-3p可靶向调控SOX6的表达,且下调miR-199b-3p表达可抑制SW620细胞的增殖并诱导凋亡,为结肠癌的治疗提供潜在的分子治疗靶点。     

miR-7调控结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的机制研究

目的 研究microRNA-7(miR-7)和5氟尿嘧啶(5-FU)联合对5-FU耐药结直肠癌(SW620/5-FU)细胞增殖、凋亡的影响,探讨miR-7表达对结直肠癌细胞5-FU敏感性的调控机制。方法 收集2019年5月—2021年7月手术切除的结直肠癌组织和癌旁组织;培养结直肠癌细胞系(HCT116、SW1116、DLD1、SW620)和正常结肠上皮细胞(NCM460),培养SW620细胞并构建5-FU耐药结直肠癌细胞(SW620/5-FU)。用RT-qPCR检测细胞和组织中miR-7的表达量。对SW620细胞和SW620/5-FU细胞均瞬时转染miR-7 mimic、miR-7 inhibitor和vector,分为miR-7 vector组(空载体组)、miR-7 mimic组(过表达组)和miR-7 inhibitor组(抑制组),以及与5-FU联合处理的miR-7 mimic+5-FU组和control组(空细胞组)。采用CCK-8法检测细胞增殖和5-FU半数抑制浓度(IC₅₀),流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测各组的cle...     

沉默INHBA-AS1靶向miR-335-3p抑制外阴鳞状细胞癌细胞增殖、迁移

目的:探讨沉默长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）INHBA反义RNA1（INHBA antisense RNA1,INHBA-AS1）对外阴鳞状细胞癌细胞SW954生物学行为的影响及机制。方法:37例外阴鳞状细胞癌组织中INHBA-AS1、miR-335-3p表达运用qRT-PCR检测,高迁移率族蛋白2（high mobility group AT-hook 2,HMGA2）蛋白的表达运用Western blotting检测。实验分为con组、si-NC组、si-INHBA-AS1组、miR-NC组、miR-335-3p mimic组、si-INHBA-AS1+miR-335-3p inhibitor组。应用CCK-8实验检测SW954细胞增殖抑制率,克隆形成实验检测SW954细胞克隆形成,Transwell实验和划痕实验检测SW954细胞迁移,流式细胞术检测SW954细胞凋亡。双荧光素酶报告实验鉴定INHBA-AS1与miR-335-3p、miR-335-3p与HMGA2的靶向关系。结果:外阴鳞状细胞癌组织中INHBA-AS1、HMGA2蛋白的表达水平远高于癌旁组织,miR-335-3p的表达水平低于癌旁组织（P＜0.05）。转染si-INHBA-AS1沉默INHBA-AS1或转染miR-335-3p mimic过表达miR-335-3p后,miR-335-3p表达水平、SW954细胞抑制率及凋亡率升高,HMGA2蛋白的表达水平、SW954细胞克隆形成数、迁移细胞数及划痕愈合率降低（P＜0.05）。INHBA-AS1靶向miR-335-3p,miR-335-3p靶向HMGA2。沉默INHBA-AS1处理的SW954细胞增殖、迁移、凋亡的影响被抑制miR-335-3p所逆转。结论:沉默外阴鳞状细胞癌细胞SW954中的INHBA-AS1通过miR-335-3p靶向HMGA2,抑制SW954细胞增殖、迁移,并诱导其凋亡。     

lncRNA SNHG16 在结直肠癌组织和细胞中表达及其调控结肠癌细胞中GPAM表达的机制

[摘要] 目的：探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）SNHG16 在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）组织和细胞中的表达及其通过海绵吸附miR-128-3p 调控结肠癌细胞线粒体甘油3 磷酸酰基转移酶基因（mitochondrial glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPAM）表达的分子机制。方法：收集2014 年1 月至2017 年1 月甘肃省人民医院肛肠科手术切除的60 例CRC患者的癌及癌旁组织标本,以及结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、Caco-2、DLD-1、HT29 和结肠上皮细胞CCD841,用qPCR法检测CRC组织和细胞系中SNHG16 的表达,分析SNHG16 表达与CRC患者临床病例特征的关系。分别用miR-128-3p模拟物、miR-128-3p 抑制剂、SNHG16 敲降载体转染SW480 细胞后,用qPCR 法检测细胞中miR-128-3p 及SNHG16 mRNA的表达,用Western blotting 法检测GPAM蛋白的表达,用CCK-8 法、克隆形成实验及细胞凋亡实验、Transwell 小室法检测细胞的增殖、凋亡及侵袭。用双荧光素酶报告基因法和RNA免疫共沉淀实验验证SNHG16 和miR-128-3p mRNA靶向结合。构建小鼠SW480细胞移植瘤模型,观察敲降SNHG16 对移植瘤生长的影响。结果：CRC组织及细胞系中SNHG16 高表达（均P<0.01）,其表达水平与CRC淋巴结转移、Duke’s 分期及患者生存期相关（均P<0.01）。敲降SNHG16 可显著抑制SW480 细胞的增殖及侵袭能力,并诱导细胞凋亡（均P<0.01）;敲降SNHG16 后小鼠移植瘤瘤体显著小于对照组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测及RNA免疫沉淀反应结果显示,miR-128-3p 与SNHG16 相互作用,且在CRC患者中miR-128-3p 与SNHG16 负相关（P<0.01)。SNHG16 通过内源性竞争海绵吸附miR-128-3p 影响其下游靶基因GPAM的表达。结论：SNHG16 在CRC细胞中可通过海绵吸附miR-128-3p 调控GPAM表达,SNHG16及miR-128-3p 可作为CRC诊断及治疗的潜在靶点。     

miR-138靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭

目的 探讨人结肠癌SW620细胞中miR-138和PDK1基因的表达,阐明miR-138对PDK1基因的靶向调控作用以及对SW620细胞侵袭性的影响。方法 培养SW620细胞并应用免疫荧光检测PDK1基因在细胞中的表达。采用生物信息学方法对miR-138和PDK1基因的靶向匹配关系进行预测并应用双荧光素酶报告基因系统鉴定。脂质体2000转染miR-138模拟物后,qRT-PCR检测miR-138和PDK1基因的表达,Western blot检测PDK1蛋白的表达,Transwell小室检测SW620细胞体外的侵袭性。结果 倒置相差显微镜下可见人结肠癌SW620细胞均匀分布,形态规则均一;细胞免疫荧光显示细胞内有PDK1蛋白的表达,显示红色荧光。靶基因预测软件miRanda和TargetScan显示miR-138和PDK1基因匹配良好,双荧光素酶报告基因系统鉴定发现miR-138能够结合PDK1 mRNA 3’UTR并有效抑制其表达。qRTPCR和Western blot检测结果表明过表达miR-138能够导致PDK1基因表达的下降。Transwell实验表明miR-138的过表达能够抑制SW620细胞的侵袭。结论 miR-138通过靶向作用于PDK1 mRNA 3’UTR能够负性调控PDK1基因的表达,并能够抑制人结肠癌SW620细胞的侵袭。     

SBF2－AS1通过调控miR－1287－5p/FSCN1轴影响胶质瘤细胞的增殖凋亡和放射敏感性

目的探讨长链非编码RNA SET结合因子2反义RNA 1(SBF2-AS1)对胶质瘤细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响及作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测正常人脑神经胶质细胞HEB和胶质瘤细胞LN18、SW1088、Hs683中SBF2-AS1、miR-1287-5p和肌成束蛋白1(FSCN1)mRNA的表达水平, Western blot检测细胞中FSCN1蛋白表达水平。以胶质瘤细胞LN18和SW1088为研究对象, 分别转染SBF2-AS1小干扰RNA(siRNA)、miR-1287-5p模拟物或FSCN1 siRNA, 采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖, 流式细胞仪检测细胞凋亡, 克隆形成实验检测细胞放射敏感性, Western blot检测cyclin D1、cleaved-caspase 3和磷酸化组蛋白2A变异体(γ-H2AX)蛋白的表达情况。采用双荧光素酶报告基因实验验证SBF2-AS1与miR-1287-5p、miR-1287-5p与FSCN1的调控关系。结果与HEB细胞比较, 胶质瘤细胞LN18、SW1088和Hs683中SBF2-AS1、FSCN1 mR...     

Mutations and Deregulation of Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR Cascades Which Alter Therapy Response

The Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascades are often activated by genetic alterations in upstream signaling molecules such as receptor tyrosine kinases (RTK). Certain components of these pathways, RAS, NF1, BRAF, MEK1, DUSP5, PP2A, PIK3CA, PIK3R1, PIK3R4, PIK3R5, IRS4, AKT, NFKB1, MTOR, PTEN, TSC1, and TSC2 may also be activated/inactivated by mutations or epigenetic silencing. Upstream mutations in one signaling pathway or even in downstream components of the same pathway can alter the sensitivity of the cells to certain small molecule inhibitors. These pathways have profound effects on proliferative, apoptotic and differentiation pathways. Dysregulation of components of these cascades can contribute to: resistance to other pathway inhibitors, chemotherapeutic drug resistance, premature aging as well as other diseases. This review will first describe these pathways and discuss how genetic mutations and epigenetic alterations can result in resistance to various inhibitors.     

Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR inhibitors: rationale and importance to inhibiting these pathways in human health

The Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascades are often activated by genetic alterations in upstream signaling molecules such as receptor tyrosine kinases (RTK). Integral components of these pathways, Ras, B-Raf, PI3K, and PTEN are also activated/inactivated by mutations. These pathways have profound effects on proliferative, apoptotic and differentiation pathways. Dysregulation of these pathways can contribute to chemotherapeutic drug resistance, proliferation of cancer initiating cells (CICs) and premature aging. This review will evaluate more recently described potential uses of MEK, PI3K, Akt and mTOR inhibitors in the proliferation of malignant cells, suppression of CICs, cellular senescence and prevention of aging. Ras/Raf/MEK/ERK and Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathways play key roles in the regulation of normal and malignant cell growth. Inhibitors targeting these pathways have many potential uses from suppression of cancer, proliferative diseases as well as aging.     

甲氨蝶呤通过RAS/MAPK/ERK/MYC/CD47信号通路抑制胶质母细胞瘤的生长

目的 研究 MTX 对 RAS 蛋白定位改变以及下游信号途径的影响,并探讨 MTX 抑制人胶质母细胞瘤细胞株 U87 生长的可能机制。方法 不同浓度的MTX（75nmol/L、375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L）处理 U87细胞后, 采用MTT 法和FCM 法分别检测细胞活力,细胞凋亡率及细胞周期。RAS-GFP 和蛋白质印迹法分别检测RAS 蛋白的分布 定位和其下游MAPK/ERK 蛋白的表达水平。采用逆转录病毒法将RAS-GFP 融合基因转导至U87 细胞,共聚焦显微镜技 术能检测到RAS 活化后定位分布,与不同的MAKP/ERK 信号途径特异性抑制剂（U0126 和 PD98059）共培养,采用蛋白 质印迹法检测MTX 对 P-P42/P44 MARK 蛋白磷酸化水平的影响以及其调控转录因子c-MYC 表达水平发的影响。50nmol/L 的 MTX 处理 U87 细胞后,进一步用 FCM 法检测细胞表面分子 CD47 的表达水平。结果  不同浓度的 MTX（75nmol/L、 375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L）均能抑制人神经胶质母细胞瘤细胞株 U87 的增殖,呈剂量依赖性, 不同浓度的MTX 可将U87 细胞阻滞于个G2/S 期,并不能直接诱导细胞发生凋亡。转导RAS-GFP 融合基因到U87 细胞 （100% GFP）,同对照组相比,用MTX 处理后发现RAS 蛋白从细胞膜转移到细胞质,从而通过降低或者抑制P-p42/p44 MARK 蛋白磷酸化水平（P ＜ 0.05）,以及抑制转录因子 c-MYC 的表达水平（P ＜ 0.05）,导致 U87 细胞生长受到抑制。 我们还近一步证明了 MTX 抑制与神经胶质母细胞瘤生长密切相关的细胞表面分子 CD47 在不同时间的表达水平。结论  我 们首次证明MTX通过改变RAS蛋白定位抑制MAPK/ERK/C-MYC信号导致神经胶质母细胞瘤U87细胞株的生长收到抑制, 细胞停滞在 G2/S 期,提示 MTX 有可能作为复发胶质瘤患者可选的治疗药物。