乳腺癌细胞外泌体对肿瘤相关成纤维细胞激活的诱导作用及机制

目的 探讨乳腺癌细胞外泌体对肿瘤相关成纤维细胞激活的诱导作用及机制。方法 (1)将乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、PBS分别与成纤维细胞MRC-5共培养;另取上述细胞和PBS,在与MRC-5共培养的同时加入外泌体摄取抑制剂GW4869。检测共培养后MRC-5细胞的迁移能力,细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、 IL-8、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)、CXC基序趋化因子配体12(CXCL12)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)、Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)、Ⅳ型胶原蛋白α1链(COL4A1)的mRNA表达水平。(2)提取MCF10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞的外泌体并鉴定,然后将上述细胞外泌体、PBS分别与MRC-5细胞共培养。检测MRC-5细胞的迁移能力,细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、 TGF-β、 CXCL12、COL1A1、COL3A1、COL4A1的mRNA表达水平,以及细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路相关蛋白的表达水平。结果 (1)相较于与PBS或MCF10A细胞共培...     

骨肉瘤外泌体中miRNA促侵袭及血管化机制研究

目的 研究骨肉瘤分泌外泌体中的miR-301 a-3p对骨肉瘤U2-OS细胞侵袭能力以及对血管内皮细胞成血管能力的作用及机制.方法 免疫荧光染色用以检测外泌体能否进入人血管内皮细胞(HUVEC)中发挥作用,Western blot法检测miR-301a-3p对于血管相关蛋白CD31及a-SMA以及信号通路蛋白表达的影响,侵袭实验检测miR-301a-3p对骨肉瘤细胞侵袭性的影响.结果 骨肉瘤细胞分泌的外泌体成功进入HUVEC中发挥作用,血管相关蛋白CD31及a-SMA含量高表达,PI3K/Akt、Mek/Erk通路蛋白高表达,血管生长能力较未处理组增强;miR-301a-3p处理后骨肉瘤细胞侵袭能力增强.结论 骨肉瘤来源外泌体中的miR-301a-3p可能通过PI3K/Akt、Mek/Erk信号通路促进骨肉瘤U2-OS细胞侵袭能力以及HUVEC的成血管能力.     

骨肉瘤细胞中端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

目的研究不同骨肉瘤细胞中人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA成分的表达情况。方法用全基因组芯片检测人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOB1．19中hTERTmRNA表达;用逆转录PCR、实时定量PCR法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOBl．19中hTERTmRNA表达。结果全基因组芯片法显示MG-63、SAOS-2、U2-OS、hFOB1．19细胞系中hTERTmRNA表达强度分别为0．9、-0．1、-0．8、11．4,各细胞系均处于相对低表达水平;荧光实时定量PCR法显示MG-63、Hela细胞系中hTERTmRNA相对表达水平分别为1．00±0．08和2．13±0．11,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论hTERTmRNA在骨肉瘤各细胞系中表达率较低,端粒延伸替代机制可能在骨肉瘤端粒维持方面发挥重要作用。     

糖皮质激素受体在3种人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS中表达及差异

目的 研究糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors,GR）在人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS的表达及差异.方法 人成骨肉瘤细胞株MG63、U2-OS及HOS购买于ATCC,常规方法培养细胞.待细胞株生长良好时,检测3种细胞株的细胞骨架、黏附力等细胞特性,通过realtime RT-PCR和Western blot法检测GR表达情况.结果 3种人成骨肉瘤细胞株有不同细胞特性,GR在3种人成骨肉瘤细胞株中表达存在差异.结论 GR在不同功能的人成骨肉瘤细胞株中表达不同.     

骨肉瘤细胞与成纤维细胞共培养刺激基质金属蛋白酶-2的产生和激活

目的：了解骨肉瘤细胞表达的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（CD147）是否能刺激临近间质细胞产生和激活细胞外基质金属蛋白酶（MMP）。方法：骨肉瘤细胞MG63和人成纤维细胞（hFb）以及抗CD147抗体共培养，用凝胶电泳和Western blot的方法检测细胞培养液和细胞膜提取物。结果：首次证实骨肉瘤细胞表达CD147，并刺激成纤维细胞产生MMP-2的激活因子MT1-MMP、MT2-MMP、前体MMP-2（ProMMP-2）和激活ProMMP-2。结论：骨肉瘤细胞高表达CD147，并刺激成纤维细胞产生和激活MMP-2。     

人参皂苷-Rf诱导骨肉瘤细胞DNA损伤和修护受损的人成纤维细胞研究

目的:探讨人参皂苷-Rf对骨肉瘤细胞和人成纤维细胞是否具有细胞凋亡和DNA损伤的作用。方法:体外培养骨肉瘤细胞系(MG-63,U-2OS,HOS和SAOS-2)和人成纤维细胞;利用MTT法检测人参皂苷-Rf对骨肉瘤细胞系和人成纤维细胞增殖的影响;再用彗星电泳和γH2AX焦点实验检测人参皂苷-Rf诱导MG-63和U-2OS细胞的DNA损伤作用;最后利用DNA梯度实验观察人参皂苷-Rf对受损人成纤维细胞的修护作用。结果:MTT显示人参皂苷-Rf对骨肉瘤细胞增殖有抑制作用。人参皂苷-Rf诱导骨肉瘤MG-63、U-2OS细胞凋亡和DNA损伤,随浓度和处理时间增加而显著增加;进一步发现人参皂苷-Rf可修复和保护发生DNA损伤和凋亡(MNNG诱导)的人成纤维细胞。结论:人参皂苷-Rf可抑制骨肉瘤细胞的增殖,同时保护和修复受损的正常细胞。因此人参皂苷-Rf不仅可以作为抗癌药物使用,同时与其它抗癌药物配合使用可以有效的降低抗癌药物对正常细胞的副作用,保护正常细胞,使抗癌药物更好的发挥作用。     

成纤维细胞与间充质干细胞来源外泌体修复急性皮肤创面的比较

【目的】本研究旨在比较成纤维细胞来源外泌体与间充质干细胞来源外泌体对小鼠急性皮肤创面的修复作用。【方法】体外分离培养原代人真皮成纤维细胞（hDF）并鉴定。用超速离心法提取人真皮成纤维细胞来源外泌体（hDF-EXO）、人骨髓间充质干细胞来源外泌体（hMSC-EXO）并鉴定;两种外泌体与hDF共培养24 h后,CCK8细胞增殖实验和划痕实验检测细胞增殖和迁移活性;采用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建急性全层皮肤切除模型,在伤口上分别局部涂敷PBS（对照组）、hDF-EXO、hMSC-EXO进行治疗。术后第0、2、4、7天观察小鼠伤口并计算伤口面积。术后第1天取伤口组织检测对外泌体摄取情况,并利用qPCR检测伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10炎症因子水平。术后第7天取伤口组织进行HE染色观察伤口组织结构变化,免疫荧光染色观察伤口组织PDGFR-α、α-SMA、Ki67表达情况。【结果】hDF表面分子及特异性标志物表达符合成纤维细胞特性。hDF-EXO和hMSC-EXO的形状、粒径、标志物均符合外泌体鉴定标准,且两者浓度差异无统计学意义（P>0.05）;体外试验数据显示...     

成纤维细胞激活蛋白在小鼠肺纤维化模型中的表达

目的探讨成纤维细胞激活蛋白（FAP）在实验性小鼠肺纤维化组织中的表达,及其与α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）之间的相互关系。方法气管内滴入博莱霉素（7mg/kg）制备肺纤维化模型,采用免疫组化技术检测小鼠肺纤维化组织中FAP、α-SMA和TGF-β1的表达。结果正常肺组织无FAP表达;纤维化组FAP表达于细支气管和大血管周围的成纤维细胞,成纤维细胞灶中FAP、α-SMA和TGF-β1表达部位相似,但FAP比α-SMA的表达更广泛,比TGF-β1的表达更强。FAP、α-SMA和TGF-β1与小鼠肺纤维化程度均呈正相关（r值分别为0.795、0.766和0.628,P〈0.01）,且FAP与TGF-β1的表达呈正相关（r=0.706,P〈0.01）。结论 FAP特异性表达在小鼠肺纤维化组织的成纤维细胞灶中,与肺纤维化程度有关。FAP与TGF-β1可能在肺纤维化形成中起协同作用。     

香烟诱导支气管上皮细胞外泌体释放miR-34a靶向CASP2促进肺成纤维细胞增殖

目的：研究香烟模拟物（cigarette smoke extract, CES）通过调控16 HBE支气管上皮细胞中外泌体miR-34a的表达，从而影响MRC-5肺成纤维细胞的增殖。方法：从市售香烟中制备CES，后将6HBE细胞经过CES处理，收集上清中的外泌体miR-34a用于MRC-5细胞培养；使用RT-PCR检测外泌体miR-34a的表达水平；MRC-5细胞增殖能力通过细胞计数试剂盒CCK-8测定；通过Western blot检测CASP2的表达，利用双荧光素酶验证miR-34a与CASP2基因的靶向结合。结果：透射电镜下，16 HBE上清液中的外泌体呈球状，粒径在100 nm左右；经过CES处理后，外泌体miR-34a的表达显著增加。进一步研究表明，通过CES诱导的外泌体miR-34a能够促进MRC-5细胞的增殖；miR-34a与CASP2存在靶向结合关系；miR-34a mimic显著抑制了CASP2的表达。结论：在CES诱导的16HBE细胞中，外泌体miR-34a通过与CASP2基因的靶向结合，对成纤维细胞增殖起着关键作用。     

骨肉瘤干细胞来源外泌体对T细胞增殖及分化的影响

目的探讨骨肉瘤干细胞(osteosarcoma stem cells,OSCs)来源的外泌体对T细胞增殖及分化的影响及其相关作用机制。方法采用无血清悬浮培养获得OSCs,并利用干细胞标志物流式分选技术进行鉴定。试剂盒提取骨肉瘤干细胞分泌的外泌体(OSCs-exo),利用透射电镜、粒径分析及Western blot实验进行鉴定。将OSCs-exo与PBMC进行共培养,CFSE染色及细胞流式实验检测其对T细胞增殖的影响。Western blot实验检测ERK信号通路中ERK蛋白的磷酸化改变。免疫磁珠分选CD4~+T细胞,并将其与OSCs-exo在不同CD4~+T细胞亚群诱导分化液中进行共培养细胞流式实验检测OSCs-exo对后者分化的影响。Western blot实验检测STAT信号通路中磷酸化STAT1、STAT3、STAT5蛋白的表达。结果成功分离获得了OSCs CD133~+MG-63,透视电镜、粒径分析及Western blot实验结果表明OSCs-exo为直径在30-100 nm的圆形或椭圆形囊泡结构,其高表达外泌体标志性蛋白CD63、HSP70。CFSE染色及细胞流式实验及Western blot实验结果显示OSCs-exo可能通过抑制ERK蛋白磷酸化抑制CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞的增殖通过抑制磷酸化STAT1、STAT3蛋白的表达抑制CD4~+T细胞向Th1、Th17并促进其向Th2、Treg细胞的分化。结论骨肉瘤干细胞来源的外泌体能够通过下调ERK蛋白的磷酸化抑制T细胞的增殖,并降低磷酸化STAT1与STAT3蛋白的表达以诱导CD4~+T细胞向Th2、Treg细胞分化,而抑制其向Th1、Th17的分化,从而下调细胞免疫功能,促进肿瘤的进展。     

蟾毒灵抑制肿瘤相关成纤维细胞介导的转移

目的 探究蟾毒灵对肿瘤相关成纤维细胞(CAF)介导的肿瘤转移的作用机制。方法 从结肠癌患者组织中提取原代CAF,命名为CAF-1和CAF-2,并在共聚焦荧光显微镜下观察其形态和表面标志物表达。同时通过Western blot检测CAF表面标志物成纤维细胞激活蛋白(FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(VIM)的表达来确认CAF身份。收集CAF条件培养基，通过ELISA实验检测条件培养液中的白细胞介素6(IL-6)分泌水平。选取人结肠癌细胞HCT116,分为HCT116组、HCT116加CAF条件培养基组，用Western blot检测HCT116上STAT3信号通路相关蛋白P-STAT3、STAT3表达情况，通过Western blot检测HCT116上皮间充质转化(EMT)的情况，再通过划痕实验和Transwell实验明确HCT116迁移和侵袭能力的改变。将HCT116分为对照组和蟾毒灵组，两组均用CAF条件培养基刺激，观察STAT3信号通路激活情况、EMT和侵袭能力的改变。结果 原代细胞呈长梭形，并表达CAF表面标志物FAP、α-SMA和VIM。ELISA实验显示C...     

IL-17抑制大鼠肾脏成纤维细胞NRK-49F向肌成纤维细胞转化

目的:研究白细胞介素-17(IL-17)对大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F)转化为肌成纤维细胞?表达细胞外基质的影响,并进一步探讨该调节作用可能涉及的分子机制?方法:以转化生长因子β(TGF-β)诱导培养NRK-49F细胞,采用Western blot检测IL-17对NRK-49F表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白的影响;并运用real-time PCR分析NRK-49F 在诱导培养24?48?72 h后细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达水平及IL-17的调节作用?最后,运用Western blot检测细胞内Smad与非Smad通路中相关信号分子的表达及其磷酸化水平,以解释IL-17对NRK-49F 调节作用的分子机制?结果:IL-17抑制NRK-49F细胞表达α-SMA,并抑制其表达细胞外基质Ⅰ型胶原和纤连蛋白?当IL-17对NRK-49F发挥上述抑制作用时,并未影响经典Smad 信号分子的表达,而是通过抑制非Smad通路Akt-TSC2-p70S6K的活化来实现的?结论:IL-17通过抑制TGF-β的非Smad通路Akt-TSC2-p70S6K的活化,从而抑制NRK-49F转化为肌成纤维细胞,并抑制其表达细胞外基质?     

大鼠结肠原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定

目的：建立简单高效的大鼠结肠成纤维细胞体外原代培养和鉴定方法,为进一步研究结肠纤维化疾病提供细胞模型。方法：取成年雄性Wistar大鼠结肠组织,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞体外原代培养,胰酶联合差速组织块贴壁培养法分离成纤维细胞,HE染色观察细胞形态表现,免疫组织化学法观察细胞中波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、S100钙结合蛋白A4（S100A4）和E钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,并与大鼠胸主动脉平滑肌A7R5细胞对比进行鉴定。结果：结肠组织块贴壁培养8d后成纤维细胞爬出,12d进入增殖时期,15~20d基本长满。倒置显微镜下观察,细胞呈扁平多突的纺锤形或星形;HE染色,成纤维细胞核大,卵圆形,着色浅,核仁明显。免疫组织化学染色,成纤维细胞Vimentin呈阳性表达,α-SMA、S100A4和E-cadherin均呈阴性表达;对照组大鼠胸主动脉平滑肌A7R5细胞S100A4呈阴性表达,α-SMA、Vimentin和E-cadherin均呈阳性表达。结论：采用胰酶联合差速组织块贴壁培养法成功原代培养出大鼠结肠成纤维细胞。     

高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化

目的 探讨高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化的作用与机制。方法 正常糖(5.5 mmol/L)及高糖(30.0 mmol/L)分别处理人肾小管上皮细胞(HK2)48 h,收集上清液提取并鉴定外泌体;观察人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)巨噬细胞是否吞噬PKH67标记的外泌体;通过检测诱导性氮氧化物合酶(iNOS)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、甘露醇受体(CD206)的表达,以确定分化为M1和M2型巨噬细胞的最佳浓度及时间点;激光共聚焦检测CD206与α-SMA、IV型胶原(Col-IV)、纤维连接蛋白(FN)的荧光共表达。qRT-PCR与ELISA法测定转化生长因子受体-β1(TGF-β1)、白细胞介素(IL)-10、IL-6水平。Western blot测定TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达。结果 上清液离心获取标本后检测到白细胞分化抗原群63(CD63)和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)阳性、内质网分子伴侣蛋白(Calnexin)阴性,确认为外泌体并且纯度较高;THP-1巨噬细胞能够吞噬各组外泌体;各组外泌体刺激的最佳浓...     

SP2509联合顺铂调控LSD1的表达而诱导骨肉瘤细胞的凋亡和自噬

目的:探究SP2509联合顺铂对骨肉瘤细胞凋亡和自噬的影响及机制。方法:qRT-PCR检测LSD1在骨肉瘤细胞MG-63、Hu O9、U-2OS以及人成骨细胞h FoB1.19中的表达。CCK8法检测SP2509和顺铂的IC50值。MG-63细胞分为对照组、SP2509组(20μmoL/L)、顺铂组(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)联合顺铂组(10μmoL/L),流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞LSD1、LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2表达。结果:LSD1在骨肉瘤细胞MG-63、HuO9、U-2OS中的表达显著高于其在hFoB1.19中的表达,MG-63中LSD1表达最高。SP2509和顺铂IG50值分别为40和20μmoL/L。相比于对照组,SP2509组和顺铂组MG-63细胞凋亡水平显著增加(P<0.05),Caspase 3表达显著增加(P<0.05),Bcl-2表达显著下调(P<0.05),LC3-Ⅱ表达显著增加(P<0.05),P62表达显著下调(P<0.001),LSD1表...     

灵芝酸A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探讨灵芝酸A对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法体外培养人骨肉瘤HOS和mg-63细胞与0.1、0.25 和
0.5 mmol/L的灵芝酸A孵育,采用CCK8检测HOS和MG-63细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞的迁移
和侵袭。Western blot 检测细胞中p-STAT3、STAT3、p-p38、p38和NF-ΚB1蛋白的表达变化。结果灵芝酸A能够显著抑制人类
骨肉瘤HOS和MG-63细胞的增殖,促进细胞凋亡以及抑制细胞迁移,并且这种效应存在剂量依赖性。与0.5 mmol/L 灵芝酸A
孵育能够显著降低HOS和MG-63细胞中STAT3的磷酸化水平,增加p38磷酸化水平,同时增加NF-κB1的表达水平。结论灵
芝酸A能够杀死人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞,可以作为抗骨肉瘤的药物进行开发。
     

hsa-miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及其对细胞凋亡的影响

目的:研究miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的过表达对其凋亡的影响。方法:构建pEZX-MR04-pre-miR-30a真核表达载体,瞬时转染人骨肉瘤细胞株U2-OS,荧光显微镜及荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测miRNA-30a在U2-OS中的表达,并采用流式细胞仪检测稳转株细胞的凋亡情况。结果:荧光显微镜下观察真核表达载体pEZX-MR04-pre-miR-30a转染后的U2-OS细胞,可见大量绿色荧光;qRT-PCR检测U2-OS中miR-30a的表达明显提高;流式细胞检测转染后的U2-OS细胞的凋亡明显增加。结论:miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS过表达能促进其凋亡,miR-30a可能是U2-OS细胞潜在的抑癌基因。     

温肺通痹颗粒对肺成纤维细胞增殖及细胞周期的影响

目的通过离体细胞实验,以MRC-5人胚肺成纤维细胞为研究对象,检测温肺通痹颗粒对MRC-5细胞的增殖及细胞周期的影响。方法将温肺通痹颗粒配制成终浓度为0.031、0.125、0.5、2、8 mg/ml的溶液,用MTT法测定细胞存活率及细胞存活周期。结果温肺通痹颗粒与MRC-5人胚肺成纤维细胞共孵育对细胞的增殖具有抑制作用,且作用效果与药物浓度及共孵育时间具有显著相关性;温肺通痹颗粒与MRC-5人胚肺成纤维细胞共同孵育,随着药物浓度的增大和作用时间的延长,G1期细胞的比例逐渐升高,G2期与S期相应降低,与对照组比较差异具有统计学意义,且呈现明显量效关系。结论温肺通痹颗粒对MRC-5人胚肺成纤维细胞具有明显抑制增殖的活性;温肺通痹颗粒对细胞的毒性非常小;温肺通痹颗粒可能具有稳定肺成纤维细胞,并抑制其大量增殖的作用。     

IL-1β对体外培养MRC-5细胞增殖、表型转化的影响

目的 探讨外源性白介素-1β(IL-1β)对体外培养的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)表型转化的影响.方法 体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以不同浓度IL-1 β(0、0.1、1、5、10ng/ml)刺激48h和同一浓度(10ng/ml) IL-1β刺激不同时间(0、24、48、72h);采用CCK-8法检测细胞增殖情况,半定量反转录聚合酶链式反应法(RT-PC R)、Western blot检测细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白水平.结果 IL-1β以浓度和时间依赖性方式调节MRC-5细胞α-SMA mRNA和蛋白表达.结论 IL-1β可能通过促进肺成纤维细胞增殖和肺成纤维细胞-肌成纤维细胞的细胞表型转化,促进气道炎症后的重塑进程.     

不同侵袭潜能的骨肉瘤细胞中抑癌基因IDH1的表达

目的 观察抑癌基因IDH1在不同侵袭能力的人骨肉瘤MG-63、U20S细胞株中的差异表达。方法培养人骨肉瘤细胞MG-63、U20S,以实时定量PCR、免疫细胞化学染色法检测MG-63、U20S细胞中IDH1基因mRNA及蛋白的表达情况;体外侵袭实验测定两骨肉瘤细胞株的侵袭能力。结果IDH1基因mRNA及蛋白在不同侵袭能力的骨肉瘤细胞株中存在差异表达,其在低侵袭力细胞株U20S中的表达量明显高于高侵袭力细胞株MG-63中的表达量（P〈0．01）。结论IDH1的表达与骨肉瘤细胞的侵袭能力呈负相关,其可作为判断骨肉瘤侵袭能力有价值的指标。