甲型H1N1流感病毒样颗粒疫苗的初步研究

目的对甲型H1N1病毒样颗粒的免疫原性和保护效果进行初步研究,为研发不依赖鸡胚生产工艺的流感疫苗提供新的思路。方法使用昆虫-杆状病毒表达系统表达并纯化甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的病毒样颗粒;通过Western blot、血凝、单向免疫扩散,透射电镜等方法鉴定病毒样颗粒;使用A/California/07/2009(H1N1)裂解疫苗作为对照,腹腔注射免疫Balb/c小鼠,并使用A/Beijing/501/2009(H1N1)进行攻毒,评价病毒样颗粒疫苗的免疫原性及保护效果。结果经鉴定,纯化后的病毒样颗粒血凝滴度为1:512,HA含量为92.9μg/ml,颗粒大小在100 nm左右,二免10 d后IgG抗体效价7.9×103,血凝抑制实验测得血抑(Hemagglutination Inhibition,HI)效价384,对50LD50的A/Beijing/501/2009(H1N1)病毒的保护率达到100%。结论甲型H1N1流感病毒样颗粒的免疫原性显著高于裂解疫苗,为发展不依赖鸡胚生产的流感亚单位疫苗提供了技术保证。     

甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性观察

目的:观察国产甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性.方法:将不同血凝素含量(20、30、40 μg/ml)各3批甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗分别免疫小鼠,腹腔注射0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针组、2针组,每组10只,2针间隔1周,同时设对照组.首针免疫后21天,分别采血,分离血清,检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价,观察疫苗的免疫原性.结果:血凝素含量为20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组血凝抑制抗体效价均小于1:40,中和抗体效价均小于1∶200;血凝素含量为30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的血凝抑制抗体效价均大于1∶40,中和抗体效价均大于1∶200;血凝素含量为30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组的血凝抑制抗体和中和抗体效价比较,差异均无统计学意义.结论:血凝素含量为30 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗接种1针即可达到理想的免疫效果.     

应用果蝇S2细胞高效表达甲型H1N1流感病毒可溶性HA蛋白及其活性分析CSCD

目的应用果蝇s2细胞表达甲型H1Nl流感病毒可溶性HA蛋白,并评估其免疫活性。方法以甲型H1N1流感A／Shenzhen／7I／09病毒株作为模版,采用RT-PCR技术扩增HA基因,构建持续性表达载体pAC5．1-HA,协同筛选载体pCoblast共转染至s2细胞,通过Blasticindin抗生素筛选获得稳定转染的s2细胞株。利用WesternBlot技术鉴定细胞上清HA蛋白表达,使用Ni亲和柱纯化重组HA蛋白。使用HA免疫BALB／c小鼠3次,利用ELISA检测HA特异性抗体效价。结果成功克隆A／Shenzhen／7I／09HA基因,长度约1．7×10^3bp。将HA基因克隆入pAC5．1-V5／His载体,经过转染、抗生素筛选后获得稳定表达HA的s2细胞株,目的蛋白以分泌形式表达于上清,相对分子质量约75×10^3D。免疫小鼠后可诱导机体产生抗HA特异性抗体,免疫后10d、30d效价分别为1：1280、1：5120。结论获得可溶性表达的HA蛋白,并具有良好的免疫活性,为后期流感免疫诊断试剂的研制、亚单位疫苗的开发、单克隆抗体的制备奠定了基础。     

SARS-CoV N蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为了研究SARS-CoV病毒N蛋白基因的原核表达及其免疫原性,为进一步的研究奠定基础,我们以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长N基因,分别克隆到pcDNA3和pET32a载体中获得重组质粒pcDNA3-N和pET32a-N。以亲和层析方法分离纯化pET32a-N转化的BL21细菌裂解液中的重组N融合蛋白,并以ELISA方法检测pcDNA3-N质粒基因免疫小鼠诱导后血清中的特异性抗体。结果pET32a-N转化BL21细菌后可检测到重组SARS-CoVN融合蛋白表达并分离纯化,pcDNA3-N基因免疫能够诱导产生N特异的体液免疫应答。研究的结果表明,SARS-CoVN蛋白可以在原核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以为进一步的功能研究和血清学诊断提供条件。     

2010年广州市甲型H1N1流感病毒分离株HA基因变异分析

目的比较2010年广州市分离到的甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因和2009年中国大陆甲型H1N1流感病毒HA基因的变异情况,为甲型H1N1流感的监测和防控提供理论依据。方法收集2010年广州市有发热和呼吸道症状病人的咽拭子标本,用H1N1流感特异性引物进行PCR检测,扩增分离到的H1N1病毒HA片段,测序后与2009年的H1N1毒株进行比对和分析,并用生物信息学方法对抗原位点和糖基化位点进行分析。结果共收集到426份标本,甲型流感阳性211份,其中H1N1流感4株,与2009年分离的甲型H1N1流感相比,有12个氨基酸碱基位点发生了有意义突变,其中6个位点位于抗原位点上;4株毒株HA基因145位氨基酸都发生了变异;其中2株毒株在第180位氨基酸位点的抗原位点发生了变异。进化分析表明4株毒株与2009年中国大陆分离的8株毒株进化关系较远。结论 2010年广州市甲型H1N1毒株与2009年相比发生了较大变异。HA基因145位和180位氨基酸位点变异对H1N1毒株抗原变异有重要意义。本文分离的A/Guangdong/ZS03/2010（H1N1）和A/Guangdong/ZS01/2010（H1N1）毒株可能已经发生了抗原性漂移。     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.     

苏州市甲型H1N1流感病毒HA基因的分子演变和遗传特征分析

目的 对新型H1N1从2009年在苏州出现至2011年度基本消失整个过程中,苏州分离株血凝素( haemagglutinin,HA)基因的变化和分子特征进行了分析.方法 提取苏州分离株的RNA,以WHO推荐的引物扩增HA基因并测序.采用生物信息学软件对苏州毒株的HA进行详细的分子特征分析,并与疫苗株及全球和全国的代表性毒株进行比对分析.结果 与疫苗株相比,5株苏州株的核苷酸序列同源性在98.8％ ～99.4％之间,氨基酸序列同源性在98.8％～99.4％之间.5株苏州株中3株在1个抗原位点突变,2株有2个抗原位点突变,且有2个抗原位点突变的都是2011年分离株.糖基化位点、二硫键和受体结合位点都没有发生改变.5株苏州株和各地的分离株都表现出按年份聚类的特点.结论 详细分析了苏州地区新型H1N1流感病毒HA的分子特征,表明苏州毒株的抗原位点上出现氨基酸残基的变化,但仍处于稳态.     

2009年甲型H1N1流感病毒HA区参照序列的建立及变异分析

2009年3月开始全球暴发了新型H1N1流感,这是继1918年、1977-1978年之后国际上第3次H1N1流感暴发,甲型H1N1流感病毒属于RNA病毒,极易发生基因变异,当变异较大时出现抗原漂移或抗原转变,不同患者来源的病毒株基因序列也具有差异性.     

2017-2019年辽宁省甲型H1N1流感病毒抗原性改变株耐药性检测及HA基因分析

目的 对辽宁省2017-2019年抗原性发生改变的甲型H1N1流感毒株进行耐药性及血凝素(hemagglutinin,HA)基因分析,了解其耐药性及抗原性变化情况,为流感的防控及临床治疗提供依据.方法 选取275株甲型H1N1流感毒株进行抗原性分析,将低反应株进行神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制剂类药...     

人感染甲型H1N1流感病毒的研究进展

2009年4月以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染甲型H1N1流感病毒疫情,WHO已于2009年4月29日将此次流感流行的预警级别不断提升至5级。现已基本明确,引起此次流感疫情的甲型H1N1流感病毒是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一种新型变异株。     

新型甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体

目的 探讨新型甲型流感病毒(2009H1N1)血凝素(HA)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体特性.方法 构建2009H1N1或1918甲型流感病毒(1918H1N1)HA蛋白表达质粒2009HA和1918HA,采用25μg或200μg剂量2009HA质粒免疫小鼠,以2009HA或1918HA蛋白为包被抗原,测定小鼠血清中2009HA抗体总量或交叉反应抗体含量,分别用2009H1N1和1918H1N1两种假病毒(pp)测定抗体中和活性.结果 25 μg或200μg的2009HA质粒加强免疫小鼠后,4～16周内两组小鼠血清中2009HA总抗体水平以及对2009H1N1pp的中和抗体滴度相似(P>0.05),都含有与1918HA蛋白交叉反应抗体,对1918H1N1pp的交叉中和抗体滴度相似(P>0.05).结论 小剂量2009HA质粒DNA疫苗能够诱导小鼠产生持久的高水平中和抗体,对于预防新现流感病毒具有潜在应用价值.     

汕头市濠江区甲型H1N1流感病毒感染状况

目的了解汕头市濠江区甲型H1N1流感感染状况,为防控措施提供科学依据。方法在2010年1-9月期间,开展3次人群甲型H1N1流感病毒感染状况横断面调查,采用血凝抑制法检测居民甲型H1N1流感病毒血清抗体,对结果进行统计分析。结果 3次人群甲型H1N1流感病毒感染血清学检测,共检测480人,总阳性率为15%,各月份阳性率逐次下降（1月为20%、3月为15.2%、9月为9.4%）;各年龄组人群中,6～岁组阳性率（30.2%）最高,16～岁组阳性率（15.1%）次之,0～岁组幼儿阳性率（8.3%）再次之,≥60岁老人组阳性率（6.3%）最低。结论濠江区人群甲型H1N1流感病毒感染率较低,人群免疫屏障尚未完全建立,适当接种甲流疫苗仍有必要。     

唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素基因序列分析

目的 分析2010—2016年唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列进化特征.方法 选取唐山市3家哨点医院流感样病例分离到的24株甲型H1N1病毒,通过RT-PCR和测序方法获得HA基因的全长序列,运用分子生物学软件和统计学软件对序列进行拼接、比对和分析.结果 同源进化分析显示,24株甲型H1N1流感病毒HA基因与疫苗株A/California/7/2009的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.0%~99.0%和97.0%~98.5%.进化分析显示,2010—2016年唐山地区流行的甲型H1N1流感病毒属于1、7、6三个基因分支,其中6分支毒株分为6C、6B、6B.1和6B.2亚支.氨基酸位点分析显示,不同毒株与疫苗株比较存在8~16处氨基酸位点改变,其中7个变异涉及3个抗原表位:H138Q/Y和S203T突变位于Ca区,N125S、K153E、S162N、K163T/Q突变位于Sa区,S185T突变位于Sb区同时也位于受体结合部位;2015—2016流行季6B.1分支毒株抗原位点S162N突变增加了新的潜在糖基化位点.结论 与疫苗株比较,随着时间推移唐山地区甲型H1N1流感病毒发生了抗原漂变,未来仍应关注6B分支流行株的变化.     

表达H1N1 亚型猪流感病毒三聚体HA 重组慢病毒的免疫原性研究

目的:探讨表达猪H1N1亚型流感病毒三聚体HA的重组慢病毒(rLV-HA-GCN4)对BALB/ c 小鼠的免疫保护效果。方法:将雌性BALB/ c 小鼠随机分为重组慢病毒rLV-HA-GCN4 组、重组慢病毒rLV-HA 组、慢病毒LV 空载体对照组及PBS 对照组,先后进行质粒和慢病毒2 次免疫,间隔为2 周,注射部位均为小鼠大腿内侧肌肉;于初次免疫后的第28天,各组小鼠鼻腔滴注50 l 100TCID50 的H1N1 病毒,采用淋巴细胞转化实验、流式细胞术、间接ELISA 和脾肺指数检测各免疫指标。结果:加强免疫后第14 天,rLV-HA-GCN4 组脾淋巴细胞转化率为0.3±0.11,与PBS 组相比,差异有统计学意义(P<0.01),产生以Th1 型CD4+ T 细胞为主的细胞免疫反应;rLV-HA-GCN4 组小鼠IgG 抗体效价可达1;8 000,攻毒后第14 天约为1 :7 000;攻毒后,rLV-HA-GCN4 组脾肺指数小于PBS 组,小鼠体重在前3 d 略有下降,随后逐渐上升,两个指标与PBS 组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:rLV鄄HA鄄GCN4 能够诱导小鼠良好的细胞与体液免疫应答,从而有效地保护小鼠抵御猪H1N1 流感病毒的感染。     

可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建

根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的研制和临床观察初步结果

目的 研制甲型H1N1流感疫苗并进行人体安全性和有效性观察.方法 用WHO推荐的甲型H1N1流感疫苗毒种按照季节性流感裂解疫苗工艺研制甲型H1N1流感疫苗,成品参照流感病毒裂解疫苗质量标准进行各项指标检定,用2批血凝素含量不同的试制产品进行临床验证.结果 血凝素含量15μg/剂和30μg/剂各1批试制产品经检定并由中国药品生物制品检定所复检,符合暂定质量标准要求.临床观察显示,960名受试者接种15μg或30μg试验疫苗1针,21 d后血清抗体阳性率、保护率均大于70%.3～11岁、12～17岁、18～59岁及≥60岁,15μg组几何平均滴度(GMT)分别较免疫前增长15、39、37和25倍;30μg组GMT分别较免疫前增长26、72、68和36倍.安全性观察结果显示15μg和30μg组总的不良反应发生率为29.38%和43.75%,其中2级反应率为6.25%和15.42%,3级反应率为0.83%和1.46%,未观察到严重不良反应.结论 按照季节性流感生产工艺研制的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗具有良好的安全性和有效性.     

湖南省甲型H1N1流感病毒感染状况及快速血清学调查研究

目的了解不同时期湖南省人群甲型H1N1流感病毒感染状况和评估方法。方法在长沙市选择14个医疗卫生机构于2009年11月至2010年3月期间,先后5次进行甲型H1N1流感病毒血凝抑制（HI）抗体阳性率快速调查,并与全省抽样调查结果比较。结果共有2131名对象参与快速调查,五次调查的全人群标准化抗体阳性率依次为9．32％、14．62％、31．08％、28．43％和22．80％;6～17岁年龄组人群的抗体阳性率最高;调查对象甲流抗体阳性中仅9．84％可归因于疫苗接种;快速血清学调查与同期全省抽样调查所得标准化抗体阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论湖南省人群的甲型流感抗体阳性率在2010年1月下旬时最高;在急性传染病大规模流行期间,可以采用小范围的快速调查评估感染状况。     

两质粒系统重配甲型H1N1流感病毒株的研究

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfastbac△plh HTBP6。同时将流感病毒A/California/7/2009(H1N1)表面基因(HA、NA)双向转录表达元件定向克隆入p ENTR-1A质粒,获得p ENTR-1AP2。将2个重组质粒共转染MDCK/COSI细胞,细胞上清接种10日龄SPF鸡胚,收取尿囊液,血凝实验筛选阳性株,并进行全面鉴定。结果本研究利用两质粒系统成功重配甲型H1N1流感病毒株,命名为TRG A/California/07/2009(H1N1)Vca,重配病毒株传代后HA效价为2~8,形态符合流感病毒典型特征,大小80~120 nm,具有冷适应、温度敏感表型。结论两质粒流感病毒拯救系统为高效重配流感疫苗株提供了新策略。