铜绿假单胞菌感染豚鼠后生物被膜形成的研究

目的 建立体内铜绿假单胞菌生物被膜模型，研究体内细菌生物被膜的组织学及细菌学特征。方法 通过吸入法使铜绿假单胞菌以气雾剂的形式吸入豚鼠肺内并生长定植，分别观察不同时期肺组织内细菌生物被膜的特征。结果 定植在肺内的铜绿假单胞菌以肉芽肿结节的形式存在，外周包绕类上皮细胞和成纤维细胞。结节内细菌被被膜基质所包绕并彼此连结，中间镶嵌宿主炎性细胞。接种后3周，肺内仍可见结节并培养出铜绿假单胞菌。结论 用吸入法可建立较稳定的铜绿假单胞菌肺感染生物被膜，其以肉芽肿结节的形式存在，宿主的反应细胞参与了生物被膜的形成。     

Elafin重组气道上皮细胞对铜绿假单胞菌生物被膜的抗菌作用

目的探讨Elafin重组气道上皮细胞对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)生物被膜(biofilm,BF)的抗菌作用。方法体外平板法制备Pa生物被膜模型,用银染法及扫描电镜鉴定。体外培养A549细胞,将pEGEP-N1-Elafin重组到A549细胞,倒置荧光显微镜观察转染情况。采用猪胰弹性蛋白酶(NE组)、铜绿假单胞菌(Pa组)上清、大肠埃希杆菌(E．coli组)上清分别诱导孵育重组细胞24 h,另设转染未含Elafin基因空载体的A549细胞作为对照组。将成熟BF载体放入4组中继续孵育8 h,扫描电镜观察4组BF结构的变化,并于第8小时用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细菌存活数。结果扫描电镜下观察到3个诱导组的BF结构较对照组的BF明显松散,尤以Pa组和NE组为甚;NE组[(3．238±0．316)×106 CFU／cm2]、Pa组细菌数量[(3．317±0．247)×106 CFU／cm2]均较对照组[(5．946±0,453)×106 CFU／cm2]显著减少(P<0．01),E．coli组细菌数量[(5．138±0．391)×106 CFU／cm2]较Pa组和NE组减少,差异均有统计学意义(P<0．01)。3个诱导组BF细菌清除率与对照组相比分别为45．6％、44．2％和13．6％。结论Elafin重组气道上皮细胞能有效清除Pa生物被膜中的细菌,而Pa产物也是Elafin表达的有效诱导物。     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其控制生物被膜的应用研究

目的 分离鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体,研究噬菌体控制宿主菌形成牛物被膜的效率.方法 以铜绿假单胞菌临床菌株为指示菌,从不同环境样品中分离噬菌体;采用限制性内切酶图谱分析和宿主范围测定方法,对分离的噬菌体进行分类;利用透射电子显微镜对分离噬菌体进行形态学研究;以TJC729为指示菌,开展噬菌体控制牛物被膜形成的应用研究.结果 分别以14株铜绿假单胞菌临床分离菌株为指示菌,共分离得到13株烈性噬菌体,命名为C1～C13.利用限制性内切酶EcoR Ⅰ分析结果表明,13株噬菌体基因组均为双链DNA,并可被分成8组;宿主谱测定结果显示,c1和C13、C6和C7、C9和C11分别具有相同的宿主范围,其余7株噬菌体的宿主范围各不相同.随机挑选噬菌体C1进行形态学研究,发现噬菌体C1头部具有二十面体结构,尾部较长且无收缩性尾鞘,属于长尾噬菌体科.生物被膜控制实验结果显示,混合噬菌体能够较好地抑制TJC729生物被膜的形成.进一步实验结果显示,噬菌体C1、C10和C12分别与牛物被膜混合培养24 h后,牛物被膜的量分别下降到初始量的32.7%、57.6%、32.8%.结论 分离了13株铜绿假单胞菌烈性噬菌体,它们能够显著抑制宿主菌生物被膜的形成,并对生物被膜造成一定程度的破坏,为控制铜绿假单胞菌引起的感染提供了一个新方法.

Abstract：

Objective To isolate and classigy the bacteriophages specific to Pseudomonas aetuginosa and to investigate biofilm control efficaey of the isolated virulent phages.Methods With P. aeruginosa clinical strains as indicators.bacteriophages were isolated by screening difierent environmental samples.Classification of the isolated phages was done with the methods of restriction fragment analysis of phage genome and host range analysis.Transmission electron microscopy(TEM)was used in phage morphology study.In biogilm control tests,TJC729 was used as the jndicator strain to study the biofilm control efficacy of the isolated phages.Results Total 13 lytic phages specific to P.aeruginosa strains were isolated and named as C1-C13.According to the result of restriction fragment analysis.all 13 phages were double-stranded DNA viruses and could be divided into eight groups.Host range experiments were conducted with 5 laboratory strains and 12 clinical strains of P. aeruginosa.The same infection profiles were observed among phage C1 and C13,C6 and C7,and C9 and C11,respectively.While the remaining 7 phages each had different unique infection profile.Phage C1 was selected randomly to study its morphology.The obtained images showed that phage C1 had an icosahedral head with a non-contractile tail,belonging to the Siphoviridae family.Compared with the single phage,phage cocktail had the best effect on biofilm control.Further experiment results showed that phage C1.C10 and C12 can destroy biofilm after treatment of the biofilm for 24 h.The biofilm amounts were deceased to 32.7%,57.6%and 32.8%of the initial values,respectively.Conclusion Thirteen virulent phages specific to P. aeruginosa had been isolated.The phages could significantly inhibit the biofilm formation and had a certain degree of damage on the biofilm.The results suggested an alternative method for the treatments of P.aeruginosa infections.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

大鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染生物被膜的致病作用研究

目的 建立慢性铜绿假单胞菌（P.aeruginosa,Pa）生物被膜（biofilm,BF）肺部感染的大鼠模型,探讨Pa生物被膜的致病作用特点.方法 体外测定左旋氧氟沙星（levofloxacin,LFX）及头孢他啶（ceftazidime,CAZ）对藻酸盐包裹的PAO579及浮游PAO579的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）.从大鼠切开的气管内注入0.1ml 10^9CFU/ml藻酸盐包裹的PAO579或浮游PAO579,术后第3、7、14天观察大鼠肺部的细菌学、病理学特点及TNF-α反应.结果 体外LFX、CAZ对藻酸盐包裹的PAO579的MIC、MBC均高于浮游PAO579.体内藻酸盐珠组的细菌形成单位（CFU）显著高于浮游菌组（P=0.002,P=0.004,P=0.002）;肺大体病理及炎症反应程度均较浮游菌组严重;肺TNF-α水平均高于浮游菌组（P=0.002,P=0.002,P=0.022）.相关分析表明,TNF-α水平与大体病理有明显相关性.结论 Pa生物被膜有保护细菌抵御抗菌药物杀伤的作用,同时有介导肺免疫损伤及保护细菌逃避宿主免疫防御作用.     

阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜和毒力因子的干预作用

目的 研究阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜形成及毒力因子分泌的干预作用.方法 2倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC);结晶紫染色法测定早期黏附;建立PAO1体外生物被膜模型;扫描电镜观察生物被膜形态;连续稀释法进行活菌计数;弹性蛋白-刚果红法测定弹性蛋白酶活性;偶氮酪蛋白法测定蛋白水解酶活性;氯仿萃取法测定绿脓菌素;苔黑酚法测定鼠李糖脂.结果 PAO1阿奇霉素组对载体的黏附低于PAO1空白对照组(P＜0.05);第3、7天PAO1阿奇霉素组生物被膜少于PAO1空白对照组,且载体活菌计数少于PAO1空白对照组(P＜0.05).PAO1阿奇霉素组弹性蛋白酶活性、蛋白水解酶活性、绿脓菌素浓度、鼠李糖脂浓度均明显低于PAO1空白对照组(P＜0.01),弹性蛋白酶活性及绿脓菌素浓度与PA-JP3株组相当(P＞0.05),而蛋白水解酶活性及鼠李糖脂浓度高于PA-JP3株组(P＜0.05).结论 阿奇霉素可以抑制铜绿假单胞菌的黏附及其生物被膜的形成,并可以抑制其毒力因子的释放.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响

目的　通过在体外复制铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa ,P .a)的生物膜 (biofilm ,BF)模型 ,研究金银花水煎液对BF的影响及其与头孢他啶 (ceftazidime ,CAZ)的协同杀菌效果。方法　选取临床分离呼吸道P .a ,采用LB(Luria Bertanimedium)肉汤系统复制体外BF模型 ,扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscopy ,SEM)观察BF ,连续稀释法进行活菌计数 ,试管二倍稀释法测定药物的最低抑菌浓度 (MIC)。结果　 37℃培养 2 4h ,P .a即表现出对固体表面的黏附性 ,3d形成早期BF ,7d形成成熟BF。金银花组P .a在固体表面的黏附数明显少于空白对照组。 6 2 .5mg/ml的金银花可以抑制和破坏早期及成熟BF ,并增强CAZ对BF内P .a的抗菌活性。结论　金银花水煎液在体外能抑制P .a对固体表面的黏附能力及BF形成能力 ,并能破坏P .a已形成的BF ,增强CAZ对BF内铜绿假单胞菌的清除作用。     

铜绿假单胞菌lasR rhlR基因缺陷对大鼠慢性肺部感染的影响

目的观察铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）PAO1野生型及群体感应（quorum sensing，QS）系统的lasR rhlR基因缺陷型Pα菌株人工生物被膜致病性的差异，及QS系统的lasR rhlR基因在Pα生物被膜感染致病过程中的地位。方法从大鼠支气管内直接予以Pα（菌种为PAO1野生型和PAO1 lasR rhlR基因缺陷型）海藻酸盐微菌粒悬液（10^9CFU／ml）攻击，建立PAO1野生型及QS系统的lasR rhlR基因缺陷型菌株人工生物被膜肺部感染动物模型。分别于感染1周和2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学及细胞因子（IL-4、IL-10）反应的变化。结果感染1周和2周后，PAO1野生型组的肺部病理学改变和细菌学改变均明显重于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组（P〈0．001）；感染1周后PAO1野生型组肺部的IL-4、IL-10水平都高于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组（P〈0．01，P〈0．05）；2周后PAO1野生型组肺部IL-10水平进一步升高（P〈0．01），明显高于PAO1 lasR rhlR基因缺陷组（P〈0．001）。结论PAO1野生型组在病程中引起持久和严重的肺部感染，激发了TH2样免疫反应，而PAO1 lasR rhlR基因缺陷组的肺部病变明显轻于PAO1组，说明QS系统的lasR rhlR基因在Pα肺部感染的建立及慢性化发展过程中发挥着重要作用。     

新型mucA基因突变的铜绿假单胞菌生物被膜的形成和藻酸盐相关基因表达的研究

目的 确定黏液型铜绿假单胞菌PA17的mum基因突变位点，研究藻酸盐合成相关基因在其生物被膜形成过程中的表达，并观察PAl7生物被膜形成过程和形态。方法 PCR方法扩增铜绿假单胞菌PA17的mueA基因全长并测序；改良平板培养法建立PA17的生物被膜模型，半定量RT-PCR测定生物被膜形成24h、3d．6d时藻酸盐合成相关基因,algD、algU和algR的表达，并进行统计学分析；扫描电镜观察不同时间点的生物被膜形态。结果 PA17的mucA基因第166～333位核苷酸片段缺失，第342位A→G；其藻酸盐相关基因algD和algU均在生物被膜形成过程的第6天表达水平最高，algR在24h表达最高，单因素方差分析显示，上述基因在生物被膜形成过程不同时间点表达的差异有统计学意义；PA17于第6天形成成熟生物被膜，形态为薄膜状。结论 PA17是一株含新型mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌，其藻酸盐相关基因在生物被膜形成的不同时间点的表达差异具有统计学意义，其生物被膜形态为薄膜状。     

铜绿假单胞菌活菌对呼吸道上皮细胞表达IL-8的影响

目的:探讨铜绿假单胞菌活菌与人呼吸道上皮细胞的相互关系,细菌对呼吸道上皮炎症反应的影响。方法:采用PAO1及ATCC 27853两株铜绿假单胞菌,在体外与培养的呼吸道上皮细胞株A549及无血清培养的人支气管上皮原代细胞相互作用,收集细胞培养上清,ELISA检测上清IL-8浓度。结果:两株绿脓杆菌均能诱导呼吸道上皮细胞IL-8分泌增加,在细菌刺激下,A549细胞IL-8分泌比对照高出5倍(P<0.05),原代上皮细胞IL-8分泌比对照高出8倍(P<0.05)。结论:铜绿假单胞菌呼吸道感染的过程中,细菌与上皮细胞的直接作用可能是呼吸道炎症反应的重要原因。铜绿假单胞菌刺激上皮细胞炎症的分子机制和信号传导值得进一步探讨。