胃癌患者手术前后CD4+CD25+调节性T细胞的变化

目的 研究胃癌患者手术前、后调节性T细胞(Treg)及FoxP3表达的变化.方法 采用流式细胞术检测20例胃癌患者术前及其中15例接受了手术者术后1周(简称术后)以及15例因胃部不适接受胃镜检查的自愿者(正常对照组)外周血中Treg数量的变化,用RT-PCR法检测Treg的特异性分子标志物FoxP3的转录水平,同时用免疫组织化学法检测胃癌组织中FoxP3蛋白的表达情况.结果 胃癌患者术前外周血中CD4+T细胞中的CD4+ CD25+比例明显高于正常对照组[(19.39±5.58)%比(9.91±3.23)%,P＜0.01],而术后CD4+ CD25+比例较术前明显下降[(13.50±5.93)%比(19.39±5.58)%,P＜0.05].胃癌患者术前外周血中FoxP3转录水平明显高于正常对照组(0.86±0.03比0.64±0.02,P＜0.01),而术后较术前明显下降(0.73±0.04比0.86±0.03,P＜0.05),提示FoxP3转录水平与Treg变化一致.胃癌患者外周血中CD4+T细胞在单个核细胞中的比例与正常对照组相比明显下降(P＜0.01),而手术前、后变化不明显.20例胃癌患者中13例胃癌癌细胞的细胞浆中有不同程度的FoxP3蛋白表达(强阳性2例,中阳性6例,弱阳性5例),7例胃癌患者的胃癌细胞中不表达.结论 Treg可能通过免疫抑制作用在胃癌的发生、发展中发挥作用,肿瘤组织本身可能是引起Treg变化的重要始动因素.     

2型糖尿病肾病患者外周血CD28/CTLA4共刺激分子的表达及其意义

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)肾病患者外周血T细胞亚群、共刺激分子CD 28及细胞毒T淋巴细胞抗原(CTLA)4的表达及其临床意义。方法:选取2015年07月~2018年06月至我科室和内分泌科治疗的患者,根据尿微量清蛋白排泄率(UAER)将其分为DM组(T2DM无肾病,n=42)和DN组(T2DM合并肾病,n=40),同时选取健康人群40例作为对照(NC组)。采用流式细胞技术测定两组患者外周血T淋巴细胞上CD4、CD8的表达,并用流式细胞技术测定CD4^+、CD8^+T淋巴细胞表面CD28、CTLA4分子的表达。结果:三组外周血CD4^+和CD4^+/CD8^+按NC组-DM组-DN组顺序均呈显著递增趋势(P<0.01),CD3^+、CD8^+按照顺序呈显著递减趋势(P<0.01),且各组间差异明显(P<0.01);三组外周血CD4^+CD28^+、CD8^+CD28^+ T细胞按NC组-DM组-DN组顺序均呈显著递增趋势(P<0.01),CD4^+CTLA4+及CD8^+CTLA4+T细胞按照顺序呈显著递减趋势(P<0.01),且各组间差异明显(P<0.01)。结论:T2DM患者T细胞亚群失衡,其中合并肾病患者表达失衡更为严重,提示糖尿病肾病患者存在自身免疫调节异常。同时T2DM合并肾病患者外周血CD28和CTLA4表达也显著异于正常对照,提示共刺激分子可能参与了T2DM合并肾病的免疫功能紊乱。     

胃癌患者外周血调节性T细胞检测及初步分析

目的 检测胃癌患者外周血调节性T细胞(Treg)水平并对其进行初步分析.方法 四色流式细胞仪检测术前胃癌患者(n=25)及正常健康者(n=25)外周血CD4+ CD25+ FOXP3+Treg水平.结果 正常对照组CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg/PBL为(1.229±0.656)%,胃癌组CD4+ CD25+ FOXP3+ Tres/PBL为(1.993±0.830)%.胃癌患者外周血Treg较正常对照组明显升高(P<0.01).结论 胃癌患者周血Treg水平升高,可因其免疫负调作用而导致免疫抑制.     

白细胞介素-15对小鼠胃癌的治疗作用

目的 建立小鼠胃癌模型,检测荷瘤状态对小鼠免疫细胞的影响,同时给予白细胞介素-15(IL-15)免疫基因治疗,以检测IL-15对胃癌的预防及治疗效果.方法 采用多因素联合攻击法诱导小鼠胃癌,同时采用IL-15表达质粒载体进行免疫基因治疗.20周后取胃标本行病理学检查,并取血及脾细胞检测T细胞亚群及CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg).同时进行自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性试验,通过统计学方法分析结果.结果 多因素联合攻击法诱导胃癌发生率为37.5％.诱癌组小鼠血清IL-15水平(9.20±2.92) ng/L明显降低(P＜0.05),且其脾NK细胞杀伤活性(216.91±117.80) U/L明显降低(P＜0.05).诱癌组小鼠外周血Treg水平(8.07±6.62)％明显升高(P＜0.05),而对照组小鼠脾细胞Treg水平(4.40±3.34)％明显降低(P＜0.05).各组小鼠之间外周血T细胞亚群变化差异无统计学意义(P＞0.05).诱癌组小鼠脾细胞CD3+T细胞水平(78.31±29.79)％明显升高(P＜0.05),而CD4+T细胞(19.98±5.77)％及CD8+T细胞水平(10.15±1.72)％明显降低(P＜0.05).结论 多因素联合攻击法为小鼠胃癌模型建立提供了良好的模型.小鼠荷瘤状态下免疫功能下降,通过IL-15免疫基因治疗可提高机免疫功能,起到抗肿瘤的效果.     

OX40信号调节抑制小鼠CD4+CD25+调节性T淋巴细胞Foxp3的表达

目的 探讨共刺激信号OX40对体外诱导的小鼠CD4+ CD25+适应性调节性T淋巴细胞(iTreg)的Foxp3表达的影响.方法 制备C57BL/6小鼠淋巴细胞悬液,经免疫磁珠法分选,获得CD4+ CD25-静息T淋巴细胞,与抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体、转化生长因子β1、白细胞介素2共孵育,诱导产生Foxp3+ iTreg.在此基础上,于培养体系中加入OX40激动型抗体及其对照抗体,利用流式细胞仪分析研究OX40信号刺激对iTreg Foxp3表达的影响.结果 C57BL/6小鼠淋巴结中CD4+ CD25+天然调节性T淋巴细胞(Treg)比例为(5.0±0.4)％,体外诱导培养的CD4+CD25+ Treg比例为(71.8±13.4)％,其中Foxp3阳性表达占(74.9±1.9)％.OX40激动型抗体组CD4+ CD25+ Treg细胞比例为(80.0±1.6)％,其中Foxp3表达水平为(59.2±0.7)％;OX40激动型抗体对照抗体组CD4+ CD25+ Treg细胞比例为(86.0±1.4)％,其中Foxp3表达水平为(70.0±0.8)％,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 静息T淋巴细胞可以在体外诱导培养获得高纯度iTreg;OX40信号刺激可以显著抑制CD25+ iTreg细胞Foxp3的表达.     

肝癌病人外周血中CD4+CD25+FOXP3+调节性T淋巴细胞表达水平的临床研究

目的 了解CD4+CD25+FOXP3+T调节性T细胞在肝癌病人外周血中的表达水平并探讨其临床意义.方法 应用流式细胞术测定18例肝癌病人外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+T淋巴细胞百分比,并与26例l临床对照者和24例健康对照者进行比较.结果 肝癌病人外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞百分比(4.25%±3.98%)明显高于临床对照组(1.34%±1.14%)及健康对照组(1.29%±0.95%)(P＜0.01),而两个对照组之间并无显著性差异(P＞0.05).CD4+CD25+FOXP3+T细胞在肝癌病人外周血所占CD4+T细胞比率(2.94%±0.91%)也较临床对照组(0.76%±0.34%)及健康对照组(0.81%±0.29%)显著升高(P＜0.001),且升高幅度强于CD4+CD25+T细胞水平,两个对照组之间并无显著性差异(P＞0.05).结论 CD4+CD25+FOXP3+T细胞是更为准确的调节性T细胞,其在肝癌病人外周血中表达水平明显升高,检测CD4+CD25+FOXP3+T水平对肝癌的预防治疗具有重要临床意义.     

不同分期前列腺癌患者外周血CD4~+ CD25~+ Foxp3~+调节性T细胞的变化及与胰岛素抵抗的相关性

目的 :观察不同分期前列腺癌患者外周血单个核细胞CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化及与胰岛素抵抗的关系。方法:采用流式细胞术检测62例前列腺癌患者(患者组,临床TNM分期Ⅰ期5例、Ⅱ期16例、Ⅲ期21例、Ⅳ期20例)外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目,计算CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T淋巴细胞的百分率;并检测其空腹胰岛素及空腹血糖水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用ELISA法测定外周血胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平,分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与胰岛素抵抗的相关性,并与42例健康体检者进行对照。结果:与健康对照组相比,前列腺癌患者HOMAIR明显升高(6.68±1.66 vs 3.68±1.42),IGF-1水平明显下降[(96.39±21.21)ng/ml vs(164.56±30.58)ng/ml],PBMC CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴细胞的百分率[(13.88±0.96)%vs(5.33±0.65)%]及CD4+CD25+Foxp3+Treg绝对值[(3.55±0.29)×107vs(1.99±0.78)×107]明显升高(P0.05,P0.01)。患者PBMC CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴细胞的百分率及CD4+CD25+Foxp3+Treg绝对数﹑HOMA-IR均随TNM分期逐渐加重而增加,IGF-1逐渐下降;相关性分析表明:CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T及CD4+CD25+Foxp3+Treg绝对数均与HOMA-IR呈明显正相关(r分别为0.689、0.722,P0.01),与IGF-1呈明显负相关(r分别为-0.896、-0.747,P0.01)。结论:前列腺癌患者存在不同程度的胰岛素抵抗,且随着疾病程度的加重,外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目和比例及胰岛素抵抗逐渐加重;CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞可能通过调节胰岛素抵抗参与其形成和发展。     

小鼠胃癌模型的建立及T细胞免疫功能的变化

目的 通过多因素联合攻击法建立小鼠原发胃癌模型并检测其免疫功能水平的变化.方法 采用BALB/C小鼠以3-甲基胆蒽(3-MCA)挂线法联合N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)灌胃法诱导小鼠胃癌.于12周及20周取血及脾细胞检测其CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg Cells)及T细胞亚群,同时取胃标本行病理学检查,通过统计学方法分析结果.结果 多因素联合攻击法诱导率为37.5%(6/16),实验组小鼠(4.52±1.97)g体质量变化有所降低(P<0.05).脾白细胞计数(372±140)×10~9升高(P<0.05).外周血(8.07±6.62)%及脾(6.45±4.13)%CD4~+CD25~+Treg细胞比例均升高(P<0.05),脾CD4~+/CD8~+细胞比值(1.95±0.62)明显升高(P<0.05).结论 多因素联合攻击法为小鼠胃癌为小鼠胃癌模型建立提供了良好的模型.小鼠胃癌发展过程中CD4~+CD25~+Treg细胞呈高表达,且在肿瘤形成后免疫功能呈现免疫抑制状态.     

经HBx转染后的肾小管上皮细胞对T细胞激活、分化的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virus x,HBx)转染人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)后其对T细胞激活、分化的影响.方法 分4组:实验组(即转染HBx质粒的HK-2细胞+CD4+T细胞)、阴性对照组(即转染HBx空载质粒的HK-2细胞+CD4+T细胞)、单独培养组(即CD4+T细胞)和空白对照组(未处理HK-2细胞+CD4+T细胞).体外培养HK-2,用分子克隆的方法构建pcDNA3.1-myc-HBx质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,实时荧光定量PCR及Western印迹法验证HBx在HK-2细胞中的表达.免疫磁珠法分选健康志愿者外周血CD4+T细胞,分别与HK-2细胞共培养,流式细胞术检测HK-2细胞共刺激分子CD40的表达、CD4+T细胞CD40配体(CD40L)表达及细胞周期情况,ELISA检测各组细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ及Th2型细胞因子IL-4水平.结果 HK-2细胞经转染pcDNA3.1-myc-HBx质粒后,可高表达HBx.转染HBx基因后HK-2细胞CD40表达显著上调(P＜0.01);与对照组相比,实验组CD4+T细胞表面CD40L表达也显著增加(P＜0.01),S期与G2/M期细胞数之和增多(P＜0.01),培养上清中IFN-γ水平升高(P＜0.05),IL-4水平降低(P＜0.05).结论 肾小管上皮细胞经HBx转染后,其共刺激分子表达上调,并促进CD4+T细胞增殖,诱导CD4+T细胞向Th1方向分化.由此推测,乙肝相关性肾炎肾组织免疫损伤所导致病变的持续进展也可能与此因素的参与相关.     

血必净促进内毒素/脂多糖刺激调节性T淋巴细胞凋亡并介导辅助性T淋巴细胞漂移的作用

目的 了解血必净注射液促进LPS刺激CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Treg细胞)凋亡过程及介导辅助性T淋巴细胞(Th)漂移的调节作用.方法 免疫磁珠法分选获得大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞,分为常规培养对照组、抗CD3/CD28组、抗CD3/CD28+LPS组、抗CD3/CD28+血必净组和抗CD3/CD28+LPS+血必净组,培养3 d后应用流式细胞术检测Treg细胞凋亡率及叉头翼状螺旋转录因子3(Foxp3)表达.将CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+T淋巴细胞1:1培养,伴刀豆球蛋白A刺激68 h,检测上清液中Th1分泌的γ干扰素(IFN-γ)、Th2分泌的IL-4、Th17分泌的IL-17水平.结果 抗CD3/CD28+LPS+血必净组Treg细胞凋亡率为(45.1±2.7)%,明显高于抗CD3/CD28+LPS组[(29.4±1.6)%,P＜0.01];2组Foxp3平均荧光强度分别为95±9、140±18,差异有统计学意义(P＜0.01).同时,抗CD3/CD28+LPS+血必净组IFN-γ分泌水平显著高于抗CD3/CD28+LPS组(P＜0.01),IL-4则呈相反变化(P＜0.05),抗CD3/CD28+LPS+血必净组IFN-γ/IL-4较对照组升高(P＜0.01);抗CD3/CD28+血必净组IL-17分泌水平较抗CD3/CD28组明显下降(P＜0.05).结论 CD4+CD25+Treg细胞活化介导了Th1向Th2功能性极化;血必净对LPS诱导的T淋巴细胞免疫功能有重要调节作用,可促进CD4+CD25+Treg细胞凋亡并介导Th2向Th1漂移,从而缓解细胞免疫抑制状态.     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对膀胱癌T24细胞杀伤作用的研究

目的：体外观察塞来昔布对人膀胱癌T24细胞株的抑制作用,并探讨其可能的机制。方法i采用MTT法检测塞来昔布对T24细胞的生长抑制作用;采用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态;采用Western印迹法检测塞来昔布作用前后T24细胞COX-2蛋白的表达变化;采用RT—PCR法检测塞来昔布作用前后T24细胞Bcl-2及Bax基因的表达变化。结果：塞来昔布（≥100μmol／L）作用24h及48h后能明显抑制T24细胞的生长并诱导凋亡;塞来昔布100μmol／L作用,24h及48h后,T24细胞COX-2蛋白表达量下降,Bcl-2基因表达亦下调,而Bax基因在塞来昔布作用24h后变化不明显,48h后表达上调。结论：塞来昔布能抑制T24细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调Bcl-2、上调Bax基因表达有关。     

川芎提取物对胰腺癌HS 766T细胞体外增殖的影响

目的：研究川芎对胰腺癌HS 766T细胞体外增殖的影响。方法：采用细胞培养的方法建立稳定传代的胰腺癌HS 766T细胞系。采用MTT法检测川芎对HS 766T细胞增殖的作用；采用PI染色、流式细胞分析技术测定川芎作用后HS 766T细胞周期的改变及细胞凋亡情况。结果：川芎可以抑制胰腺癌HS 766T细胞的体外增殖。川芎可以通过阻滞HS 766T细胞G0／G1轴，抑制细胞增殖；通过增加合成期细胞百分比促进细胞凋亡的产生。结论：川芎在体外可以抑制胰腺癌HS 766T细胞的增殖。     

肛管及肛周鳞癌13例分析

强调肛门指诊是发现、诊断肛管癌及肛周癌的重要手段。大剂量放疗及以放疗为主,化疗、手术为辅的综合疗法是肛管癌及肛周癌的重要治疗方法。与单纯手术相比,5年生存率有所提高,并且可减少结肠造口的痛苦,改善患者的生活质量。肿瘤分期,是否有腹股沟淋巴结转移,治疗方法以及肿瘤周围组织的免疫反应对患者的预后均有影响。     

Stem Cell Characteristics in Prostate Cancer Cell Lines

Background

Recent studies indicate the presence of a small, stem-like cell population in several human cancers that is crucial for the tumour (re)population.

Objective

Six established prostate cancer (PCa) cell lines—DU145, DuCaP, LAPC-4, 22Rv1, LNCaP, and PC-3—were examined for their stem cell properties in vitro.

Design, settings, and participants

The colony-forming efficiency and self-renewal ability of morphologically distinguishable holoclones and paraclones were tested with low-density plating and serial passaging. Expression of the putative stem cell marker CD133 and breast cancer resistance protein (BCRP) was examined with flow cytometry, and immunohistochemical stainings were made for CD133, α2-integrin, nestin, BCRP, cytokeratin 5 (CK5), and cytokeratin 18 (CK18).

Results and limitations

Five out of six cell lines formed clear holo-, mero-, and paraclones. Unlike paraclones, we can maintain DU145 holoclones in culture for several passages, which is indicative of self-renewal ability. Using fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis only in DU145 cells, a small fraction (0.01%) of CD133⁺ cells was detected. CD133⁺ cells; however, like DU145 BCRP⁺ (0.15%) cells, they were not more clonogenic, and they did not show more holoclone formation than the marker-negative cells or unselected cells. Immunohistochemistry revealed α2-integrin and BCRP as potential stem cell markers and CK5 with the combination of CK18 to distinguish transient amplifying cells.

Conclusions

These results indicate the possible presence of stem-like cells in several established PCa cell lines. CD133 selection does not enrich for stem-like cells in PCa cell lines.     

肺癌干细胞标志物的研究现状

肺癌具有高度异质性,能够抵抗化疗药物治疗,5年生存率小于15%。尽管我们关于肺癌的知识在不断增多,但仍很难确定肺癌的异质性和耐药性的发病基础。肿瘤干细胞模型近年来吸引了很多注意力,通过这种模型可以解释各种肿瘤的异质性、耐药性、休眠、复发和转移。肿瘤干细胞理论较少涉及肺癌研究。本文综述了肺癌干细胞的鉴定方法,包括其细胞表面标志物和生物学特征,还讨论了肺癌干细胞与肺癌预后的关系,从而为消灭肺癌干细胞、攻克肺癌提供理论依据。     

胃癌肿瘤干细胞在腹膜种植中的作用机理假说

目的 探讨肿瘤干细胞（CSC）在胃癌腹膜转移中可能的作用机理,并提出假说。方法 对CSC在胃癌腹膜种植转移中可能的作用机理进行综述,并提出系统性的理论假说。结果 肿瘤转移干细胞（MCSC）系具有转移特性的CSC亚群,但目前尚鲜有相关研究。MCSC转移是其趋向性迁移并定植到特定靶组织的多步骤“归巢”过程。胃癌腹膜转移是简化的“归巢”模式,可认为其关键环节是MCSC在腹膜的黏附、迁移和微环境的建立。捕获人胃癌腹膜转移灶的MCSC,并鉴定其干细胞性、高成瘤性及高侵袭性,是以MCSC为线索的胃癌腹膜转移机理研究的重要环节。结论 MCSC可能在胃癌腹膜种植的多环节过程中发生作用,但目前尚缺乏相关研究结果。     

生长抑素对胆囊癌细胞生长周期的影响

目的：探讨生长抑素作用下胆囊癌细胞分裂周期的变化。方法：选择梯度浓度的生长抑素作用于人胆囊癌细胞株，观察浓度依赖性生长曲线；同时，运用流式细胞仪观察胆囊癌细胞周期在生长抑素作用下的变化。结果：随生长抑素浓度的递增；胆囊癌细胞株的生长逐步受到抑制（P＜0．05）。生长抑素作用后1d，胆囊癌细胞周期停滞于S期，随后，细胞凋亡率明显上升。结论：生长抑素在较高浓度下能够抑制胆囊癌细胞的生长，其机制在早期为诱导生长停滞，随后则诱导细胞凋亡。