靶向TNF-α RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建质粒重组体,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.方法:原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,15%DMEM培养液调细胞浓度为2×107cells/L接种于6孔板,3 mL/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24 h后ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度、RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段克隆入质粒载体,转化DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析.结果:LPS刺激巨噬细胞24 h后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度较对照组下降最明显(P<0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达较对照组被抑制了61.20%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.     

短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体C5aR基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达C5aR shRNA的细胞系。实验分为3组,①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染C5aR shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,γ计数仪测定125I标记的C5a与RK3E的结合情况。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P0.01),C5aR mRNA水平显著降低(P0.01),125I标记的C5a与RK3E结合活性显著下降。结论:针对C5aR的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。     

靶向大鼠TGF-β1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shRNA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1.1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。     

靶向大鼠TGF-β1基因shRN A真核表达载体的构建及鉴定

构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shR-NA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1．1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

RhoA基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建针对RhoA基因的,hRNA表达载体并进行鉴定.方法:针对人RhoA的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo质粒,构建重组体pGPU6/GFP/NeoRhoA,进行酶切及测序鉴定,然后脂质体转染LoVo细胞.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体,酶切及测序证实质粒为所需的序列.结论:成功地构建了针对RhoA基因的shRNA表达载体,为下一步进行RNAi的相关研究奠定了基础.     

靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

质粒介导的RNAi技术对大鼠CⅡTA和MHCⅡ基因表达抑制的检测

目的 研究应用质粒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对大鼠MHC Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclass Ⅱ transactivator,C Ⅱ TA)和MHC Ⅱ基因表达的抑制作用.方法 根据大鼠CⅡTA基因信息,设计合成3条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)并构建质粒载体,于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞(DC)及体内转染大鼠脾脏,采用实时定量RT-PCR技术检测转染后DC和脾脏的C Ⅱ TA及MHCⅡ的mRNA表达变化,流式细胞术检测转染后MHCⅡ蛋白表达变化.结果 成功构建shRNA质粒载体,3个shRNA质粒转染组的DC和脾脏转染后的CⅡTA和MHC Ⅱ的mRNA表达水平及MHC Ⅱ抗原表达水平均明显减低(P<0.01),其中第1条shRNA的质粒转染组抑制效果最侍,C ⅡTA与MHCⅡ基因表达呈正相关.结论 应用C Ⅱ TA靶向shRNA质粒载体在体内外均能显著抑制C Ⅱ TA和MHC Ⅱ基因表达,为进一步基因治疗研究奠定实验基础.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段,连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

本研究构建了真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4,并观察了其在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达情况。提取新生鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法扩增Brn-4的基因片段,用基因重组技术将Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,测序及PCR进行鉴定;将重组质粒应用脂质体转染的方法转入MSC中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。经酶切及DNA测序结果证实pEGFP-Brn-4表达质粒的DNA序列完全正确,将此质粒转染MSC后Brn-4基因获得表达。研究结果提示成功构建真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4,且Brn-4基因可在MSC中表达,为后续探讨Brn-4修饰的MSC治疗老年痴呆的可行性奠定了基础。     

RNAi介导Caspase-3基因及其抑制LPS诱导肾脏上皮细胞凋亡的研究

目的：探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法：构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体质粒pRNAT—U6．1-Caspase-3shRNA，用电穿孔法转染RK3E细胞，经G418筛选后，形成稳定的表达Caspase-3shRNA的细胞系。实验分为3组：①正常对照组：未转染的RK3E细胞；②阴性对照组：转染空载体pRNAT-U6．1的RK3E细胞系；③实验组：转染Caspase-3shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖（LPS）孵育12小时后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，RT-PCR检测mRNA的表达，以及各组Caspase-8蛋白的活性。结果：与正常对照组和阴性对照组相比，实验组的细胞凋亡率显著降低（P〈0．01），Caspase-3的mRNA水平和蛋白活性显著降低（P〈0．01）。结论：针对Caspase-3的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默，进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

Runx1-shRNA重组质粒的构建与表达

本研究目的在于构建特异性下调人Runx1基因的shRNA表达质粒。设计并合成人Runx1基因的siRNA,通过DNA重组技术将目的序列插入到pSuper质粒,采用菌落PCR、限制性内切酶酶切技术及测序方法对其进行筛选与鉴定。转染该质粒于人肺腺癌细胞A549,通过实时荧光定量PCR技术和Western blot方法分别从基因及蛋白水平对其进行功能鉴定。实验结果表明我们所构建的pSuper-Runx1-shRNA质粒能够有效抑制A549细胞Runx1mRNA和蛋白的表达,抑制率分别为33%和50%。     

脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9 c2心肌细胞凋亡有何影响。方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9 c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响。结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9 c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9 ...     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.     

shRNAs 介导的EM>Smad2/EM> 基因在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达的沉默

目的 通过构建5个shRNA表达质粒,对转化生长因子β/Smads信号通路中受体调节性Smads蛋白中的Smad2的表达进行抑制.方法 针对鼠Smad2基因的mRNA序列,设计合成了5条shRNA-Smad2 DNA序列,分别插入至shRNA表达载体中,获得了5个shRNA-Smad2表达质粒,将shRNA表达质粒转染NIH/3T3细胞,采用半定量RT-PCR和Western blotting方法,检测shRNA表达质粒对Smad2表达的抑制效果.结果 编号为2.4的shRNA-Smad2表达质粒能够显著降低Smad2的表达,同时发现由不同的shRNA-Smad2表达质粒组成的RNAi池,产生的抑制效果比单个RNAi表达质粒的抑制效果明显提高.结论 成功地构建了特异、高效抑制Smad2表达的shRNA表达质粒.     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法

目的探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法。方法利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒。用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中。用W estern b lot、免疫荧光和MTT法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性。结果成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求。pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC。在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强。结论以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能。     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1)基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的 LRIG1 mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。 目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。 方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。 结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1- shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2- LRIG1-shRNA1(LRIG11)细胞和pGenesil2- LRIG1-shRNA2(LRIG12)细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negative shRNA分别下降47.9%(P < 0.01)和32.8% (P > 0.05)。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。