HPA-1a抗体MAIPA定量检测标准体系的建立

目的建立针对人类血小板抗原HPA-1a抗体的血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定定量检测(MAIPA)的标准体系。方法用MAIPA方法检测不同稀释度的标准HPA-1a抗血清,优化该方法的最佳实验条件,绘制线性标准曲线,并对该方法的敏感度、特异性、准确度和精密度进行了分析。结果经优化,确定MAIPA定量检测方法的最佳实验条件如下:铺板抗体羊抗鼠Ig G单抗:3μg/m L,血小板每孔2×107个,检测抗体小鼠抗人CD61单抗:20μg/m L,酶标羊抗人Ig G:稀释度1:10 000。该方法的线性检测范围是0-4 IU。该方法最低检测限至少为0.3 IU,批内变异系数为1.3%-3.6%,批间变异系数为4.0%-5.6%。特异性检测:用抗-A、抗-B、抗-H、抗-I、抗-P1、抗-Lewisa等试剂以及含其他抗体的抗血清进行试验,均无明显阳性。结论本研究建立的针对HPA-1a抗体的MAIPA定量检测的标准方法具有较高的敏感度、特异性、准确度和精密度,对于临床相关疾病的诊断和血小板安全输注具有重要的应用价值。     

HPA-1a抗体SPR技术定量检测方法的建立

目的:建立针对人类血小板抗原(HPA)-1a抗体的表面等离子体共振(SPR)技术定量检测方法.方法:以氨基偶联法在芯片表面偶联重组蛋白,采用SPR方法检测不同浓度的标准抗血浆样本,优化实验条件,在检测范围内绘制标准曲线,并分析其敏感性、特异性、准确性和精密度.结果:利用SPR技术建立针对HPA-1a抗体的定量检测方法,...     

HPA-1a同种免疫妇女的T细胞对HPA-1a和HPA-1b多肽在体外的增殖反应

胎儿血小板可能被母亲的抗血小板(-HPA)-1a同种抗体(NAITP)破坏。这种抗体在纯合子的妇女体内的应答反应受主要组织相容性复合物(MHC)限制(DRB3*0101),因此其T细胞在体外会对GPⅢa分子序列的亮氨酸33(HPA-1a)反应。作者研究T细胞在体外对HPA-1a和HPA-1b多肽(aa 20-39和aa 24-45)的反应T细胞的HPA-1a同种免疫的妇女的外周血单个核细胞(PBMC)。将多肽和对照抗原加入PBMC中,T细胞增殖反应以对3H胸腺嘧啶的摄取量进行分析。作者测试了来自10名妇女的17个样本:5名妇女的7个样本对HPA-1a多肽反应呈弱阳性,2份原发性血小板减少性紫癜(ITP)妇女的样本也对HPA-1b(20-39)多肽呈弱阳性。其它10个样本的     

抗血小板抗原 3a,5b(HPA-3a,5b)引起的新生儿同种免疫血小板减少症

抗血小板抗原３ａ，５ｂ（ＨＰＡ－３ａ，５ｂ）引起的新生儿同种免疫血小板减少症胡翊群ＦＢｏｅｈｌｅｎ夏文权王鸿利新生儿同种免疫血小板减少症（ＮＡＩＴ）是由胎儿与母亲的血小板抗原不合所致。我们报道１例患儿和母亲存在两种血小板抗原型不合，母亲血清中被检测出...     

重组设计的抗体用于HPA-1a定型

人类血小板抗原—1(HPA-1)同种抗原是由于GPⅢa上第33位氨基酸的替换而形成,。HPA-1a对于HPA-b纯合子,且DRB3*0101阳性的病人是强免疫原。1/365的妊娠可产生抗-HPA-1a抗体,1/1100的新生儿可产生严重的血小板减少症。用人类重组抗-HPA-1a单链抗体片断的V基因,作者研制了2个抗体分子(完全IgG1和双体物质),用于简单快速的检测HPA-1a表现型。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG1用于间接流式细胞仪试验,检测50份全血标本只需孵育20分钟,用中等强度荧光能清楚的鉴别HPA-1a阳性和阴性血小板。为检测血浆中溶解的HPA-1a,研究了一种简单的2步血凝试验,这种试验拥有抗-Dx和抗-HPA-1a双特异性物质。对1002份随机血浆标本进行检测,22个为HPA-1a阴性(2.2％)。这个基于双性物质的试验,最适合对供者或孕妇的筛选。同时流式细胞仪可用于紧急标本表现型的快速检测或用于确定血液成分的HPA-1a状态。     

化学发光免疫定量检测狂犬病毒抗体方法的建立

目的建立化学发光免疫法检测人血清中狂犬病毒抗体。方法以纯化抗原包被固相,配以碱性磷酸酶标记抗原及金刚烷胺作为发光底物,采用双抗原夹心法检测血清中抗体。结果该方法的敏感性为0.2 IU/m l,线性范围为0~200 IU/m l,变异系数<10%,回收率在90%~110%之间。结论化学发光法定量测定人血清中狂犬病毒抗体是一种灵敏、准确、重复性好,操作简单的方法,适用于临床检测。     

乙型肝炎病毒表面抗体化学发光定量检测方法的建立

目的 建立一种宽线性、定量的乙型肝炎病毒表面抗体化学发光检测方法.方法 以纯化的HBsAg包被96孔白色发光板;将ALP用改良过碘酸钠法标记纯化的HB8Ag;以中检所国家标准品标定HBsAb定标品,优化反应条件,建立双抗原夹心HBsAb化学发光法.结果 新建立的HBsAb化学发光法灵敏度可达2mIU/ml;批内和批间变异系数(CV)分别为4.4%～6.5%和7.3～9.1%;可测范围为5～2000mIU/ml;添加回收率为92.3～107.6%,稀释回收率为91.7～110.4%;检测20份中检所阴性参考品,结果全小于10mIU/ml;5～2000mIu/ml检测范围线性相关系数r=0.994;与Abbott AxSYM系统的相关性γ=0.941(n=213),阴性符合率为98.1%,阳性符合率为82.6%.结论 新建立的HBBAb化学发光定量检测方法的各项指标均达到临床检测要求.     

荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立

目的建立并评价从血液标本中检测5种假丝酵母菌的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法以5种假丝酵母菌共有的高度保守序列为靶序列,设计特异引物和探针进行检测,优化定量PCR体系,并进行方法学评价。结果建立的荧光定量PCR方法,其线性范围为101~109CFU/m L;灵敏度为5 CFU/m L;批内和批间CV值均5%;对19份模拟血液标本进行检测,其中分别含有5种假丝酵母菌的标本均为阳性,而分别含有常见血液感染曲霉菌和细菌的检测结果均为阴性。结论建立的检测血中假丝酵母菌荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,可对常见的临床血液感染假丝酵母菌进行定量检测。     

第2例HPA-5a抗体所致输血后紫■经静脉内免疫球蛋白成功治疗

先前有输血史或怀孕史致敏的个体,在输入含血小板血液成分7—10天后,发生严重的血小板减少症,输血后紫癜(PTP)相当罕见。虽然大多数PTP为针对HPA-1a(P1A1)的同种抗体所致,本例却是第2例表现为抗-HPA-5a相关PTP。1例     

PCR-SSP对畲族人群的HPA-1～5的基因频率检测

人类血小板同种抗原(human platelet alloantigen,HPA)具有高度多态性.HPA的分型对于诊断同种免疫引起的血小板输注无效、新生儿同种免疫血小板减少性紫癜、输血后紫癜等有重要意义.为了解浙江畲族人群HPA-1～HPA-5的基因频率,笔者采用PCR-SSP方法对部分畲族人群标本进行检测,报告如下.     

HPA-1-28w基因分型检测技术体系的建立和广西瑶族、汉族人群HPA-1-28w基因多态性研究

目的建立HPA-1-28w基因分型检测技术体系并用以研究广西瑶族和汉族人群的血小板抗原(HPA)-1-28w基因多态性。方法通过设计序列特异性引物和优化PCR反应条件,摸索HPA-1-28w基因分型检测技术体系,其组成包括前期已建立的HPA-1-17w多重PCR-SSP技术和新研发的HPA-18-28w PCR-SSP方法 2部分组成。使用10例已预先测序确定HPA-18-28w基因型和20例已预先使用商品试剂盒检测HPA-18-21w基因型的本研究广西瑶族标本,对新研发的HPA-18-28w PCR-SSP方法做验证。应用所建立的HPA-1-28w基因检测技术对广西地区无血缘关系的1424名健康瑶族人和908名健康汉族人做HPA-1-28w基因分型和多态性分析。结果所建立的HPA-1-28w基因分型技术系统,不仅对HPA-18-28w基因的分型结果与对验证用标本的测序分型结果完全一致,而且对HPA-18-21w基因的分型检测结果与商品试剂盒的分型结果完全一致。广西瑶族人群的HPA各等位基因频率分别为:HPA-1a 0.998 2、1b 0.001 8,2a 0.874 6、2b 0.125 4,3a 0.661 5、3b 0.338 5,5a 0.996 8、5b 0.003 2,6a 0.9786、6bw 0.021 4,15a 0.407 7、15b 0.592 3;汉族人群HPA各等位基因频率分别为:HPA-1a 0.998 3、1b 0.001 7,2a0.957 6、2b 0.042 4,3a 0.532 5、3b 0.467 5,4a 0.999 4、4b 0.000 6,5a 0.984 0、5b 0.016 0,6a 0.989 0、6bw 0.011 0,15a 0.534 1、15b 0.465 9;广西瑶族和汉族人群的HPA-7-14w、HPA-16-28w基因均以aa纯合子形式存在。在本组广西瑶族人群中发现2例罕见的HPA-6bb纯合子基因型个体,而在汉族人群中发现了1例中国人群中罕见的HPA-4ab基因型个体。结论建立了完善的HPA-1-28w PCR-SSP基因分型检测技术体系,并成功应用于广西瑶族和汉族人群的HPA-1-28w基因筛查和分型研究;广西瑶族、汉族人群HPA基因频率分布在HPA-2,-3,-5,-15系统和HPA-6w等均不同(P0.05),藉此有助于了解广西瑶族和汉族人群HPA的免疫学特点。     

国内首例抗HPA-5b引发的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜的检测、诊断及分析

本研究旨在探讨抗HPA-5b抗体引发的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜（NAITP）的实验检测及临床诊断。临床监测患儿血小板计数及其他临床表现;多重PCR及DNA测序检测患儿及其父母HPA-1—21bw系统基因型;流式细胞术（FCM）和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测技术（MAIPA）检测及鉴定患儿及其母亲血清中的血小板特异性抗体。结果表明：患儿临床症状较轻,基因分析显示患儿为HPA-5ab,父亲为HPA-5ab,母亲为HPA-5aa;患儿母亲血清中含与父亲血小板反应的血小板特异性抗体为抗HPA-5b抗体。结论：该病例为抗HPA-5b抗体引起的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜。     

乙肝表面抗体定量检测方法对比分析

目的检测乙肝表面抗体（抗-HBs）浓度,指导及时接种乙肝疫苗。方法收集张家口市第二医院住院患者血清1 000份,采用胶体金及放免法检测抗-HBs并对其进行分析。结果 1 000份血清中,胶体金免疫层析法检测阳性458例,放射免疫定性法阳性468例,放射免疫定量法482例阳性。结论及时接种乙肝疫苗,预防乙肝并降低感染率,采用定量法检测抗-HBs浓度,是目前理想方法。     

贵州黔东南州苗族人群HPA-1～5、15多态性调查

目的 调查贵州省黔东南州苗族健康随机献血人群人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA) 1-5、15系统基因多态性分布特点.方法 采用聚合酶链-序列特异性引物技术(PCR-SSP)对贵州省黔东南州无血缘关系苗族随机献血人群100例血样进行HPA-1～5、15系统基因分型.结果 贵州省黔东南州苗族HPA-1a、2a、3a、4a、5a、15a基因频率分别是0.950、0.900、0.830、0.985、0.975、0.585,HPA-1b、2b、3b、4b、5b、15b基因频率分别是0.050、0.100、0.170、0.015、0.025、0.4150;与其他研究比较:HPA-1与新疆维吾尔族、海南黎族、中国汉族相比较差异有统计学意义(P＜0.05);HPA-2与新疆维吾尔族、海南黎族、菲律宾、泰国相比较差异有统计学意义(P＜0.05);HPA-3与我国其它研究相比较差异均有统计学意义(P＜0.05);HPA-4与其它研究相比较差异无统计学意义(P＞0.05);HPA-5与国内新疆维吾尔族相比较差异有统计学意义(P＜0.05);HPA-15与新疆维吾尔族、海南黎族族、印度尼西亚相比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 贵州省黔东南州苗族人群HPA分布具有本地人群特点.本组HPA数据分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,可以作为贵州省黔东南州苗族HPA基因分布频率数据库和血小板供者HPA资料库.     

人诱骗受体3酶联免疫定量检测方法的建立

目的建立检测人诱骗受体3(DcR3)含量的ELISA方法。方法建立固相双抗体夹心法定量检测DcR3:用抗DcR3抗体包被ELISA板,捕捉样本中DcR3,再加入生物素标记的抗DcR3抗体及亲合素标记的辣根过氧化物酶,形成含酶的固相复合物,最后以底物显色,以同板上的标准曲线定量。对所建立的方法进行灵敏度、特异性、精密度、回收率、线性范围及血浆DcR3参考范围的评估。结果所建立方法分析灵敏度为0.051 ng/m L,重复性和期间精密度分别小于10%和15%,平均回收率为90.50%。在包被抗体中加入2倍量抗TNF-α、在检测抗体中加入10倍量生物素标记的抗LIGHT、抗FAS或抗TNF-α或在DcR3标准品中加入10倍量的LIGHT纯蛋白,均不影响标准曲线的状态。检测方法的线性范围为0.25~16 ng/m L(r≥0.98)。128例正常成人血浆DcR3的均值为(0.21±0.05)ng/m L,95%可信限参考值范围为0.14~0.28 ng/m L,无年龄及性别差异。结论所建立的ELISA检测方法具有特异性高、灵敏度、精密度及线性好、可测范围大等特点,可用于检测人血DcR3含量。     

人IFN-λ1-3型mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立人IFN‐λ1‐3型mRNA实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT‐PCR）检测方法。【方法】根据人IFN‐λ1‐3型mRNA的基因序列合成特异性引物及探针,用体外转录方法制备IFN‐λ1‐3型的mRNA标准品,建立人IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法。【结果】IFN‐λ1‐3型RNA标准品与对应的CT 值有良好的线性关系;扩增效率均在90％～100％之间;灵敏度分别是：1×100 co pies／μL、1×101 co pies／μL、1×101 co pies／μL ;变异系数均小于2％;各型间交叉反应不明显。【结论】本研究建立的IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法灵敏度高,具有良好的重复性及特异性。