雌激素受体在人乳腺癌MCF-7细胞阿霉素敏感株和耐药株中的变化及意义

目的研究MCF 7人乳腺癌细胞阿霉素敏感株 (MCF 7)和耐药株 (MCF 7/ADR)细胞中雌激素受体 (estrogenreceptor,ER)表达的变化与其对细胞生物学特性的影响。方法采用Westernblot法检测MCF 7细胞和MCF 7/ADR细胞中雌激素受体表达 ,RT PCR检测 2株细胞ERmRNA的表达水平 ,MTT法检测细胞增殖及细胞对雌激素 (estrogen ,E2 )和屈洛昔芬 (droloxifene ,Dro)的敏感性 ,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果经Westernblot检测 ,MCF 7细胞ER为阳性 ,而MCF 7/ADR细胞ER为阴性 ,采用RT PCR可检测到MCF 7细胞中ER的mRNA ,而在MCF 7/ADR细胞则检测不到。经MTT分析 ,与MCF 7相比 ,MCF 7/ADR细胞生长速度减慢 ,细胞多分布于G0 /G1期。E2 在 1× 10 -12mol/L的浓度时开始促进MCF 7细胞的生长 ,到达 1× 10 -9mol/L时促生长作用进入平台期 ;而任何浓度的E2 对MCF 7/ADR细胞均无促生长作用。Dro的浓度达到 10 μmol/L的时候 ,开始出现对MCF 7细胞生长的浓度依赖性抑制 ,当Dro浓度达到 2 0 μmol/L时对MCF 7/ADR细胞的生长出现明显抑制 ,且高于对MCF 7细胞的抑制。结论MCF 7/ADR细胞雌激素受体表达缺失 ,缺失发生在mRNA水平以上 ,细胞生长速度减慢 ,同时细胞失去对雌激素的依赖性。     

小干扰RNA引发多药耐药乳腺癌细胞内MDR1基因沉默的研究

目的　研究小干扰RNA(siRNA)抑制耐药乳腺癌细胞系MDR1基因表达的可行性。方法　选用耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF7/ADR及其药物敏感细胞系MCF7作为研究对象。将预先设计的siRNA包装入质粒载体 ,然后转化质粒到大肠杆菌中 ,经过克隆、扩增、纯化后转染到MCF7/ADR细胞中 ,10 0mg/L潮霉素筛选 2周 ,用流式细胞术从蛋白水平检测P gp的表达率 ,及作实时定量聚合酶链式反应从基因转录水平检测MDR1基因的表达率。结果　流式细胞术检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后P gp的表达率由99.8%下降到 12 .3 % ;作为阳性对照的转染过GFP基因的LA795细胞的GFP蛋白表达率由 74.8%下降到 10 .6%。实时相对定量PCR检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后其Ct值由 2 5 .2 2增加到 3 0 .64。结论　siRNA能抑制人乳腺癌多耐药细胞系MCF7/ADR内MDR1基因表达 ,从而为逆转肿瘤细胞的耐药性提供了一种新的方法。     

葡萄籽多酚对人乳腺癌细胞MCF-7/ADR在裸鼠体内的多药耐药逆转作用

目的　研究葡萄籽多酚 (GSP)对人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF 7/ADR的体内多药耐药逆转作用。方法　采用人乳腺癌裸鼠移植瘤模型研究GSP对肿瘤多药耐药的体内逆转作用 ;采用流式细胞术测定不同用药P 糖蛋白 (Pgp)表达变化及肿瘤细胞凋亡率变化。 结果　体内裸鼠抑瘤实验显示GSP有一定抑瘤作用 ,抑制率为 18 35 % ,联合应用阿霉素 (ADR)可显著抑制肿瘤生长 ,2 0mg/kgGSP可有效逆转MCF 7/ADR细胞的耐药性 ,抑瘤率为 5 4 6 4 %。流式细胞术结果显示应用GSP后肿瘤细胞Pgp表达显著降低 ( 32 0 3± 2 0 9) ,与对照组 ( 5 5 13± 2 12 )相比差异有显著意义 (P <0 0 5 )。平均凋亡率为 15 12 %± 1 0 4 % ,显著高于对照组 9 0 7%± 0 4 3% (P <0 0 5 )。结论　GSP能在体内逆转MCF 7/ADR细胞的耐药性 ,其机制可能是通过抑制Pgp表达 ,并可能通过诱导肿瘤细胞凋亡来起作用     

肿瘤坏死因子-α基因抑制耐药性人乳腺癌细胞的研究

目的 观察肿瘤坏死因子－α（TNF-α)基因对耐药细胞生长的抑制作用及机制。方法 以重组逆转录病毒为载体将TNF－α基因导入耐药性人乳腺癌细胞系MCF7／ADR，获阳性克隆MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2。体外观察并比较野生型和转基因癌细胞的生长速度，流式细胞仪分析细胞周期的变化。端粒酶重复扩增实验（TRAP）综合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银梁法测定端粒酶活性的变化。结果 MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2细胞中有TNF－α基因的整合和表达，病毒上清中TNF－α含量分别为1737μg/L（10^6个细胞／48h）、2875μg/L。与阴性对照细胞相比，MCF7／ADR－TNF1与MCF7／ADR－TNF2细胞的生长速度明显减慢，生长抑制率分别为32.4%、54.8%，细胞周期阻滞于S＋G2／M期，端粒酶活性降低。结论 外源性TNF－α基因的导入能有效抑制耐药细胞，阻滞细胞周期、抑制端粒酶活性可能为其主要机制。     

畸胎瘤细胞源性生长因子对雌激素受体阴性乳腺癌细胞雌激素依赖性的影响

目的分析乳腺癌细胞雌激素依赖性与畸胎瘤细胞源性生长因子（PC—cell derived growth factor,PCDGF）表达之间的关系,探讨雌激素受体（ER）阴性乳腺癌患者接受内分泌治疗的可能性。方法荧光定量聚合酶链反应检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-435s中PCDGF的表达,CCK-8法检测不同浓度雌激素培养条件下细胞的存活情况。以ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7为对照,用RNA干扰技术抑制ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中PCDGF基因的表达,观察抑制前后雌激素依赖性的变化。结果PCDGF在4株乳腺癌细胞系中均有不同程度的表达,其中在MDA-MB-435s中表达量最高,PCDGF高表达的乳腺癌细胞系的雌激素依赖性较高,PCDGFshRNA可以有效抑制乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-213中PCDGF的表达（抑制率分别为81．1％和86．7％）。MDA-MB-231细胞系雌激素依赖性增加的程度高于MCF-7细胞系（P〈0．05）。结论PCDGF高表达于ER阴性乳腺癌细胞,抑制其表达可能会更好的逆转内分泌治疗的耐药性。     

葡萄籽多酚逆转人乳腺癌多药耐药性及其机制的研究

目的探讨葡萄籽多酚 (grapeseedpolyphenols ,GSP)逆转肿瘤多药耐药的作用及其相关机制。方法以人乳腺癌MCF 7细胞及其耐药株MCF 7/ADR细胞作为实验对象 ,用MTT法观察GSP对MDR的逆转作用 ,采用Westernblot、Northernblot检测GSP对MDR1基因表达的影响 ;流式细胞术 (FCM)观察GSP对P 糖蛋白 (P gp)功能的影响。结果非细胞毒性剂量GSP 1 2mg/L、2 4mg/L均能逆转MCF 7/ADR细胞的多药耐药性 ,逆转倍数分别为 5 77和 9 79倍 ;1 2mg/L、2 4mg/LGSP分别使P gp表达降至对照组的 80 83% (t=5 5 8,P <0 0 5 )和 5 0 81% (t =10 96 ,P <0 0 1) ;1 2mg/L、2 4mg/LGSP下调MDR1mRNA表达 ,降至对照组的 6 0 92 % (t =16 0 3,P <0 0 0 5 )和 4 2 0 5 % (t =2 1 70 ,P <0 0 0 5 ) ;2 4mg/LGSP可增加细胞内阿霉素 (ADM)的积累。结论体外试验证实GSP具有多药耐药逆转作用 ,是一种潜在的化疗增敏剂。     

MK-2206 逆转人乳腺癌细胞耐药的作用及机制研究

目的：探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂MK-2206对人乳腺癌细胞耐药的逆转作用及机制。 方法：用CCK-8法检测阿霉素与MK-2206对MCF-7细胞（阿霉素敏感）与MCF-7/ADR（阿霉素耐药）细胞生长的抑制情况并计算各自IC50值。根据IC50结果,选择低毒浓度阿霉素单独或联合不同浓度MK-2206处理MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞后,分别用CCK-8法和流式细胞术检测MK-2206对阿霉素耐药与阿霉素诱导细胞凋亡的影响,以及对MCF-7/ADR细胞内阿霉素蓄积的影响。用MK-2206 单独作用MCF-7细胞与MCF-7/ADR细胞后,采用Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。 结果：阿霉素与MK-2206作用后,两种细胞的增殖均受到明显抑制,阿霉素对MCF-7/ADR的IC50值明显高于MCF-7的IC50值（P<0.05）,而MK-2206对两种细胞的IC50差异无统计学意义（P>0.05）。联合MK-2206可明显降低阿霉素对两种细胞IC50值,但MCF-7/ADR细胞的降低程度明显大于MCF-7细胞（P<0.05）;MK-2206对阿霉素诱导的MCF-7细胞凋亡影响不明显,但能明显增加MCF-7/ADR细胞的凋亡率（P<0.05）。不同浓度MK-2206对MCF-7/ADR细胞内阿霉素的蓄积差异无统计学意义（P>0.05）。单独MK-2206处理后,MCF-7细胞p-（Thr308）Akt蛋白表达明显下调（P<0.01）,但p-（Thr246）PRAS40蛋白表达无明显改变（P>0.05）;MCF-7/ADR细胞以上两种蛋白的表达均明显下调（均P<0.05）。 结论：MK-2206可以通过抑制PI3K/Akt信号通路来部分逆转人乳腺癌细胞的耐药性,且乳腺癌细胞耐药可能主要与该通路的PRAS40蛋白活化有关。     

TRAIL联合阿霉素诱导肝癌耐药株凋亡的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)及TRAIL和阿霉素(ADM)联用对肝癌耐药株诱导凋亡的作用。方法通过浓度递增法用阿霉素处理人肝癌细胞株HepG2获得肝癌耐药株HepG2/ADM。并通过MTT方法鉴定耐药株的耐药性。构建可溶型TRAIL真核表达质粒真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL。通过脂质体(Lipofectamine)2000介导转染质粒入HepG2/ADM。通过RT-PCR和Westernblot证实转染的HepG2/ADM有sTRAIL的mRNA和蛋白的表达后,用MTT方法和AnnexinVFITCPI染色流式细胞仪检测单纯TRAIL处理和联合阿霉素处理HepG2/ADM的生长抑制率和凋亡率。并用共聚焦显微镜观察处理后细胞凋亡的形态。结果肝癌耐药株筛选成功,sTRAIL质粒构建、转染成功。用MTT测HepG2/ADM抑制率阿霉素处理组40.9%;TRAIL处理组29%;合用组58.4%;联合后抑制率有显著差异。凋亡检测为阿霉素处理组18.37%;TRAIL处理组14.8%;合用组52.71%。但TRAIL处理HepG28.9%和HepG2/ADM8.54%的凋亡率无显著差异。结论TRAIL联合阿霉素能明显增加HepG2/ADM的凋亡从而逆转耐药。同时单纯TRAIL治疗对耐药株作用与亲代细胞作用相仿,说明TRAIL可能有另外的诱发凋亡的途径,受HepG2/ADM耐药性的影响小。     

乳腺癌他莫昔芬耐药与雌激素受体β亚型表达的关系

目的 探讨雌激素受体亚型β(ERβ)及其剪切变异体ERβcx表达与乳腺癌他莫昔芬治疗耐药的关系。方法 将MCF-7细胞、MCF-7/TAM-R细胞(他莫昔芬耐药株)以及5-氮杂胞苷(5-AZA-CdR)去甲基化作用后的MCF-75-AZA细胞和MCF-7/TAM-R5-AZA细胞采用Western blot检测ERα、ERβ和ERβcx蛋白的表达;将MCF-7细胞作为对照,用他莫昔芬干预上述细胞,噻唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 ERα的表达在各组间无明显差异;ERβ的表达差异有统计学意义(P＜0.01),在MCF-7/TAM-R组细胞中最低,在MCF-75-AZA组中最高;MCF-7和MCF-7/TAM-R组的ERβcx表达差异无统计学意义(P＞0.05),但明显低于MCF-75-AZA和MCF-7/TAM-R5-AZA组的表达(P＜0.01)。MTT检测结果显示,与对照组比较,他莫昔芬干预后MCF-7/TAM-R 细胞增殖速度差异无统计学意义(P＞0.05);而MCF-7、MCF-75-AZA和MCF-7/TAM-R5-A细胞生长均受到抑制,其中MCF-75-AZA细胞受抑程度强于MCF-7细胞(P＜0.01),而MCF-7/TAM-R5-AZA细胞受抑制的程度低于MCF-7细胞(P＜0.01)。流式细胞仪测定这3组细胞的S期比率都明显下降。结论 ERβ蛋白表达和他莫昔芬治疗内分泌治疗敏感相关,ERβcx蛋白表达与耐药无关,但可能与ERβ共同影响乳腺癌对他莫昔芬治疗的敏感性。5-AZA-CdR去甲基化可以诱导乳腺癌细胞ERβ及其剪切异构体ERβcx表达增强,改善他莫西芬治疗效果。     

沙利霉素逆转P-gp介导的肾癌ACHN细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨沙利霉素对肾癌ACHN细胞多药耐药的逆转及其机制.方法 实验分为对照组、阿霉素组、沙利霉素组及阿霉素和沙利霉素联合用药组,药物作用24 h后,CCK-8方法 检测肾癌细胞的生长活性,免疫细胞化学法检测肾癌细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达情况.结果 10 μg/ml 阿霉素对肾癌ACHN细胞的生长抑制率仅为4.758%.沙利霉素组对肾癌ACHN细胞生长抑制率呈剂量依赖性,并高于阿霉素组(P<0.05),其中以10 μmol/L组抑制率最高(达17.555%).联合用药组的生长抑制率高于沙利霉素组及阿霉素组(P<0.05),以10 μmol/L 沙利霉素 +10 μg/ml 阿霉素组的抑制率最高(达45.447%).与阿霉素组比较,经沙利霉素处理过的肾癌ACHN细胞中的P-gp蛋白表达下降(P<0.05).结论 沙利霉素增强了肾癌ACHN细胞对阿霉素的敏感性,耐药性逆转的机制之一可能与沙利霉素下调癌细胞中P-gp的表达有关.     

人乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶基因的表达和意义

目的：探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）基因在人乳腺癌细胞的表达及意义。方法：体外培养人耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7／ADR和人敏感乳腺癌细胞MCF-7，MTT法检测MCF-7／ADR细胞耐药倍数，RT-PCR法检测两种细胞GCSmRNA的表达，免疫细胞化学法检测GCS蛋白表达水平。结果：MCF-7／ADR细胞耐药倍数为53倍，RT—PCR检测结果显示两种细胞均有GCSmRNA表达，且MCF-7／ADR细胞GCSmRNA表达水平较MCF-7细胞有显著升高（P〈0．05），免疫细胞化学结果显示二者GCS蛋白均有表达且表达水平有显著差异（P〈0．05）。结论：GCS基因在乳腺癌细胞中表达，GCS对于乳腺癌的发生发展具有重要作用，GCS在耐药乳腺癌细胞的高表达证明GCS与肿瘤耐药密切相关，为肿瘤耐药的逆转治疗提供了新的方向。     

Cdc42在人乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株中的表达

目的探讨细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株MCF-7/Adr中表达的变化以及对细胞耐药性的影响。方法将Cdc42 siRNA转染MCF-7/Adr细胞株后,用RT-PCR和Weastern Blot方法检测MCF-7组,MCF-7/Adr组,MCF-7/Adr siRNA干扰组细胞Cdc42的转录以及蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定siRNA处理后阿霉素(ADM)对MCF-7/Adr细胞的杀伤作用;用荧光分光光度计测定细胞内ADM药物浓度。结果 MCF-7/Adr细胞中Cdc42 mRNA及蛋白表达量显著高于MCF-7细胞(P0.05);siRNA干扰后Cdc42表达受到明显抑制(P0.05),并显著提高细胞内ADM的浓度(P0.05)。结论特异性siRNA能明显抑制Cdc42 mR-NA及蛋白表达,并逆转细胞耐药性。     

腺病毒介导的野生型p53基因逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的研究

目的 探讨野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的逆转作用及其机制.方法 选用含野生型p53基因的重组腺病毒载体,转染乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A,绘制细胞生长曲线,利用流式细胞计数仪检测细胞周期分布及凋亡分析、TUNEL法检测细胞凋亡的发生,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹转移检测p53基因的表达情况.结果 野生型p53基因转染MCF-7/A后的24、48 h均检测到p53基因的表达,并显著抑制MCF-7/A细胞的增殖;细胞周期发生改变,转染后的MCF-7/A的G0%G1期DNA百分含量(76.22%)明显高于对照组(43.64%,P<0.05),凋亡率(10.76%)与对照组(1.48%)之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A的耐药性有明显的逆转作用,其机制可能是引起明显的G1期阻滞并诱导细胞凋亡.     

原癌基因gankyrin在乳腺浸润性导管癌中的表达研究

目的 探讨gankyrin在乳腺浸润性导管癌中的表达水平及其在乳腺癌发生发展中的作用机制。方法 采用蛋白免疫印记的方法 检测28例乳腺浸润性导管癌的癌与癌旁组织中gankyrin的表达水平；采用经典的分子克隆技术构建gankyrin的真核表达质粒；利用双报告基因技术检测p53活性的变化；利用蛋白免疫印记技术检测p53、p21和Bax的蛋白水平。结果 gankyrin在28例乳腺浸润性导管癌癌组织的表达明显高于癌旁组织，在MCF-7细胞中，过表达的gankyrin明显抑制了p53的转录活性，使p53、p21和Bax的蛋白水平最著降低。结论 gankyrin对p53的负调控在乳腺浸润性导管癌的发生过程中起重要作用。     

沉默XIAP基因对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究siRNA（small interfering RNA）对MCF-7细胞株XIAP（X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。方法 体外转录法合成特异性针对人XIAP基因的siRNA；荧光标记法标记XIAP siRNA；脂质体法将siRNA转人MCF-7细胞；流式细胞仪检测siRNA的转染效率；半定量RT-PCR及Western blot法检测siRNA对XIAP基因表达的抑制作用；MTT法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用；TUNEL法观察siRNA诱导细胞凋亡的作用。结果 siRNA的转染效率在一定剂量范围内随浓度的增加而增加，siRNA转染组XIAP mRNA表达水平可下调约77%，对照组mRNA表达水平无明显改变。细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性。荧光显微镜下观察肿瘤细胞发现，siRNA50、100、200nmol/L转染组出现典型的凋亡形态学变化。结论 体外转录合成的siRNA能特异有效下调XIAP基因的表达，瞬时转染XIAP siRNA能有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，低剂量XIAP siRNA对瘤细胞显示了显著的抗增殖作用。     

CD326在乳腺癌细胞系的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系

目的 探讨上皮细胞黏附分子(CD326)在乳腺癌细胞系中的表达及其与乳腺癌细胞耐药的关系.方法 流式细胞仪分析MCF-7、MCF-7/ADR及MDA-MB-231中cD326表达情况;细胞计数法(CCK-8法)检测流式细胞仪分选获得的CD326阳性和阴性细胞亚群体外对表阿霉素、多西他赛耐药情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同细胞亚群中多药耐药基因(MDR1)及乳腺相关耐药基因(BCRP)的表达情况.结果 MCF-7/ADR中CD326的表达(31.03%)明显高于亲本株MCF-7(27.02%),MDA-MB-231中CD326的表达(33.43%)明显高于MCF-7及MCF-7/ADR;MCF-7和MDA-MB-231中CD326阳性细胞亚群对表阿霉素及低浓度多西他赛(0.25～1.0*IC50)的体外耐受性明显高于阴性细胞亚群(P＜0.01),但对高浓度多西他赛(1.5～2.0* IC50)的体外耐受性差异无统计学意义(P＞0.05);CD326阳性与阴性细胞亚群间MDR1、BCRP基因表达差异元统计学意义(P＞0.05).结论 CD326与乳腺癌化疗药物的耐药有关,其诱导耐药并不是通过经典的耐药途径.