siRNA沉默Annexin-1基因对膀胱癌T24细胞顺铂耐药的影响

目的 观察RNA干扰沉默膜联蛋白-1(Annexin-1)基因表达技术对膀胱癌T24细胞Annexin-1基因表达和顺铂耐药的影响.方法 针对Annexin-1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小分子干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞,转染后应用半定量RT-PCR和Western印迹检测Annexin-1 mRNA 和蛋白的改变,用MTT法检测沉默Annexin-1表达在膀胱癌T24细胞对顺铂敏感性的变化.结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin-1的mRNA和蛋白水平显著下降(P＜0.05),增强细胞对顺铂的敏感性(P＜0.05).结论 RNA 干扰Annexin-1基因后其mRNA 和蛋白水平显著下降,并且增强T24细胞对顺铂的敏感性.     

Survivin基因沉默对膀胱癌T24细胞增殖及对塞来昔布敏感性的影响

目的研究Survivin基因沉默对人膀胱癌T24细胞增殖和对化疗药物塞来昔布敏感性的影响。方法设计合成Survivin的siRNA序列,Lipofectamine TM 2000转染入T24细胞。采用RT-PCR和Western印迹检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法察Survivin基因沉默后T24细胞对塞来昔布的敏感性。结果 Survivin基因沉默48 h后,T24细胞的Survivin基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少。塞来昔布的敏感性显著性增强。结论 Survivin特异性siRNA能显著沉默T24细胞Survivin基因表达,抑制细胞增殖,并增强T24细胞对塞来昔布的敏感性。     

PDECGF-siRNA诱导膀胱癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默血小板源性内皮生长因子基因(platelet-derived endothelial cell growth factor, PDECGF)表达诱导人膀胱癌细胞凋亡的机制.方法 针对人PDECGF mRNA序列设计合成编码干扰RNA (siRNA) 的DNA模板, siRNA;构建含RNA聚合酶启动子Ⅲ转录载体pRNAT-U6/Neo并能形成发夹结构小干扰RNA(siRNA)的psiPDECGF质粒;用其转染人膀胱癌T24细胞株,采用RT-PCR、Western 印迹法观察转染前后PDECGF基因及相关基因表达变化,采用凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳及吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡.结果 显示PDECGF siRNA对膀胱癌T24细胞中PDECGF基因表达产生明显抑制作用;转染psiPDECGF-2细胞组PDECGF mRNA水平明显降低,上述重组质粒可诱导T24细胞凋亡,同时caspase-3、p53蛋白水平明显增高.结论 证实psiPDECGF-2可抑制PDECGF在T24细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.其机制与caspase-3、p53蛋白水平表达增高有关.     

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对胰腺癌细胞增殖的影响

目的:探讨polo-like kinase-1(PLK1)基因在胰腺癌细胞中的作用.方法:采用PLK1小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,siRNA)转染人胰腺癌Mi- aPaCa-2细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平,观察PLK1 siRNA转染对胰腺癌细胞体内外增殖的影响.于转染不同时间后收集细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测胰腺癌细胞凋亡情况.结果:胰腺癌MiaPaCa-2细胞经siRNA转染处理后,PLK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05).PLK1基因siRNA可明显抑制癌细胞体外生长(P<0.05)和体内裸鼠模型增殖(P<0.05).细胞凋亡检测发现,DNA电泳出现明显的梯度图谱,且与浓度相关(r=0.836,P<0.05).TUNEL结果显示,转染组癌细胞凋亡指数明显增加,且呈时间和浓度依赖性(r= 0.875,P<0.05).结论:PLK1 siRNA转染可明显抑制胰腺癌细胞增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡有关.     

siRNA靶向沉默YAP1对卵巢癌细胞skov3增殖凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(si RNA)靶向沉默Yes相关蛋白(YAP)1基因表达对人卵巢癌细胞skov3增殖凋亡的影响。方法采用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将靶向干扰YAP1的siRNA转染至对数生长期skov3细胞(siYAP1组),同时设不行转染处理的对照组和转染随机序列siRNA的转染对照组(si Control组),转染48 h后采用实时定量PCR(qPCR)检测各组的YAP1 mRNA水平;采用水溶性四氮唑(WST-1)法评价各组转染后的增殖情况,分别采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术及qPCR检测转染后凋亡率及凋亡相关蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和促凋亡蛋白Bid、Bax)的mRNA水平,PI单染流式细胞术检测转染后的细胞周期分布情况。结果 qPCR法检测发现si YAP1组转染48 h后的YAP1 mRNA水平为(0.141±0.018),低于对照组和siControl组(均P<0.05),提示在skov3细胞中靶向沉默YAP1成功;skov3细胞经siRNA靶向沉默YAP1表达后的生长增殖受明显抑制、凋亡形态明显改变及发生G0/G1期细胞周期阻滞,与对照组和siControl组相比,siYAP1组的增殖抑制率、凋亡率、促凋亡蛋白水平及G0/G1期细胞比例均升高,而促凋亡蛋白水平及S期细胞比例均降低(P<0.05);对照组和siControl组增殖、凋亡及细胞周期相关指标的差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过siRNA在基因水平上沉默YAP1表达可抑制skov3细胞的增殖并诱发凋亡和细胞周期阻滞,在卵巢癌的靶向治疗中可能有一定前景。     

RNA干扰沉默Twist基因对人膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的 研究RNA干扰沉默Twist基因对人膀胱癌T24细胞周期和增殖的影响.方法 体外构建Twist基因的shBNA表达载体,Li-pefectamin 2000介导转染膀胱癌T24细胞,采用RT-PCR和Western印迹方法检测特异性shRNA对Twist基因沉默效果,转染后采用MTT法检测shR-NA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析细胞周期的改变.结果 Twist基因的shRNA表达载体有效下调Twist基因表达(P<0.05).与对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1期阻滞,RNA干扰后,G1期细胞从(48.17±1.62)%增加到(74.34±3.24)%(P<0.05),s期细胞从(33.71±3.54)%减少到(11.58±1.02)%(P<0.05).结论 Twist-shRNA表达载体可以特异高效地抑制膀胱癌T24细胞Twist基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

RNAi抑制人大肠癌LOVO细胞Bmi-1基因的表达

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因表达对人大肠癌细胞株LOVO增殖和侵袭力的影响及机制。方法将化学法合成的针对Bmi-1mRNA不同位点设计的3对siRNA序列（siR-NA1～3）和1对带有荧光标记的FAM-siRNA（siRNA4）转染至人大肠癌LOVO细胞,荧光显微镜下观察siRNA的转染效率,QRT-PCR检测Bmi-1mRNA表达抑制作用,Western Blot检测Bmi-1蛋白表达变化,MTT法检测LOVO细胞体外增殖变化,小室侵袭实验检测LOVO细胞侵袭能力。结果利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达70%。siRNA1对mRNA表达抑制率最高,从而筛选出沉默效应最强的siRNA序列为siRNA1。siRNA1转染组LOVO细胞Bmi-1蛋白表达,增殖及侵袭力明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。结论化学合成的靶向Bmi-1siRNA转染人大肠癌LOVO细胞能有效抑制Bmi-1的mRNA和蛋白质表达水平,Bmi-1基因的RNA干扰可有效抑制人大肠癌LOVO细胞的增殖和侵袭能力。     

SFRP1基因沉默抑制人胃黏膜上皮GES-1细胞失巢凋亡

目的观察RNA干扰沉默分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1基因对人胃黏膜上皮细胞(GES)-1失巢凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法应用SFRP1基因小干扰RNA(siRNA)转染处理GES-1后,分别采用Realtime RT-PCR和Western印迹检测SFRP1 mRNA和蛋白表达。细胞悬浮培养应用Poly-HEMA方法。采用流式细胞术和Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测细胞失巢凋亡,软琼脂集落实验检测细胞非锚定生长状态,免疫荧光和Western印迹实验检测SFRP1沉默后Wnt通路中β-catenin的定位及表达,Realtime RT-PCR检测β-catenin靶基因c-Myc和CyclinD1 mRNA表达。结果与对照组比较,siRNA-891组中SFRP1 mRNA和蛋白表达明显被抑制。siRNA-891组细胞失巢凋亡率明显下降(P0.05),EthD-1荧光染色的失巢凋亡细胞数目明显减少(P0.05),软琼脂集落形成数目明显增多(P0.05)。siRNA-891组中β-catenin蛋白表达水平明显增加,其靶基因c-Myc mRNA和CyclinD1 mRNA表达明显增高(P0.01)。结论 SFRP1siRNA可抑制GES-1细胞失巢凋亡,使其失巢凋亡敏感性下降,激活Wnt分子通路可能是其机制之一。