维吾尔族不同龋敏感儿童变形链球菌临床分离株表面蛋白A区遗传多态性研究

目的:分析维吾尔族高龋和无龋儿童变形链球菌临床分离株表面蛋白A区基因遗传多态性与其黏附能力的关系。方法:通过细菌贴壁法进行维吾尔族儿童高龋组(dmft≥5)和无龋组(dmft=0)变链菌临床株黏附试验。选取黏附能力较强和较弱的菌株,提取细菌DNA,经PCR扩增其表面蛋白A区编码基因spaP-a后,利用限制性内切酶HaeⅢ进行限制性片段长度多态性分析。结果:高龋组黏附能力(33.92±8.79)%强于无龋组(27.53±7.45)%,差异有统计学意义(P<0.05)。经HaeⅢ酶切后,高黏附力组和低黏附力组变链菌均出现了A、B两种基因型,且在两组菌株中的分布情况不同,A基因型在高黏附力组居多,B基因型在低黏附力组居多,差异有统计学意义(P<0.05)。测序证实spaP-a基因的特异性碱基突变引起酶切位点改变而产生基因多态性。结论:维吾尔族不同龋敏感儿童变链菌临床株spaP-a基因具有得遗传多态性可能是其黏附能力出现差异的原因之一。     

变形链球菌葡糖基转移酶遗传多态性与龋病发生关系的研究

目的:探讨变形链球菌葡糖基转移酶遗传多态性与龋病发生的关系。方法:菌株分别选自本实验室前期工作中分离鉴定的合成水不溶性多糖能力较强和较弱的血清c型变形链球菌临床分离株，提取全菌DNA，经PCR扩增gtfBC(961 - 5574 by)后，分别采用限制性内切酶Hinf工、Mb。工和Taq工进行限制性片段长度多态性分析。结果: 不同龋敏感人群变形链球菌血清。型临床分离株经Hinf工酶切后限制性片段长度多态性分析酶谱出现了差异，有 1.9 kb长片段的菌株在高龋组中的比例高于无龋组(P < 0.05)。结论:萝基因型的不同是导致菌株合成水不溶性多糖能力差异的原因之一。     

变形链球菌表面蛋白遗传多态性与龋病发生关系的研究Ⅱ表面蛋白V区、P区编码基因序列的测定

目的 :对不同粘附力变形链球菌临床分离株表面蛋白V区、P区编码基因进行序列测定。方法 :实验菌株选自本实验室前期工作所获得的spaP pv经AluI酶切后呈不同基因型的不同粘附力血清c型变形链球菌临床分离株。提取全菌DNA ,经PCR扩增表面蛋白V区、P区编码基因spaP pv( 2 0 60～ 3 15 7bp)后 ,进行序列测定。结果 :不同粘附力变链菌临床株spaP pv经AluI酶切后呈a、b 2种基因型的菌株测出的spaP pv序列均有 7个AluI酶切位点 5′ AG↓CT 3′。 10株a型菌株序列除了几个碱基点突变外均相同 ,9株b型菌株序列亦如此。a型有 2个DNA片段与b型不同 ,经分析 ,这 2个变异片段均位于V区。结论 :变链菌临床株表面蛋白粘附性能的差异可能是编码基因可变区域V区出现变异所致     

变形链球菌F-ATPase亚基基因uncEBF基因多态性的研究

目的研究变形链球菌临床分离株耐酸因子F- ATPase亚基c、a、b联合基因uncEBF的遗传多态性,并探讨基因多态与细菌耐酸力的关系。方法选取18株变形链球菌高耐酸株、20株低耐酸株,以特异引物从细菌组DNA扩增uncEBF,行限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）和测序比较。结果不同限制性内切酶RFLP产生不同的基因型,测序证实了导致多态出现的基因变异;其中内切酶AluⅠ产生的A、B基因型在不同耐酸力菌株的分布不同（P<0.05）,高耐酸性菌株中A型基因uncEBF的检出高于低耐酸力菌株。结论变形链球菌F- ATPase亚基联合基因uncEBF具有明显基因多态性,酸性环境下生存力强的菌株可能出现基因的适应性变异,可认为不同基因型uncEBF分布与耐酸力不同相关。     

变形链球菌F-ATP酶亚基基因uncA遗传多态性的研究

目的研究变形链球菌临床分离株耐酸因子F—ATP酶亚基α的结构基因uncA的遗传多态性，并探讨基因多态性与细菌耐酸力及龋病发生的关系。方法分别从高龋、无龋个体中分离变形链球菌34和30株，其中包括18株高耐酸株、20株低耐酸株。从细菌组DNA扩增uncA，行限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）及核酸测序比较。结果不同限制性内切酶RFLP产生不同的基因型，测序证实了导致多态出现的基因变异；内切酶Hph Ⅰ产生的A、B基因型在不同患龋个体分离菌株的分布不同（P〈0．05），A型uncA在高龋分离株的检出率高于无龋分离株；内切酶MboⅡ产生的C、D基因型在不同耐酸力菌株中的分布不同（P〈0．05），C型uncA在高耐酸力菌株的检出率高于低耐酸力菌株。结论变形链球菌F—ATP酶的α亚基基因uncA具有明显遗传多态性，酸性环境下生存力强的菌株可能出现基因的适应性变异，不同基因型uncA分布与菌株的耐酸力及致龋力相关。     

变形链球菌表面蛋白可变区(extended-V)的遗传多态性分析

目的:从分子水平探讨变形链球菌(血清c、f型)表面蛋白可变区(extended-V,V )的遗传状况,分析其基因中存在的变异,为进一步研究其结构和功能提供遗传信息。方法:选择临床最常见的血清型c、f型菌株117株(包括7株参考株),提取DNA,行PCR扩增,获得SrV 区片段基因;利用限制性内切酶DdeI进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),并与部分国际参考株进行比较归类。从所占比例较多的基因型中,各选一代表株的PCR产物分别测序,将测序结果用Clone3.1version软件比较各型酶切位点。结果:117株菌株共分出5种基因型(A、B、C、D、E型);血清f型OMZ175为其中的一种;A型48株,B型45株,C型20株,D、E型则分别只有1株和3株,显示出明显差异;以参考株基因型为准,分别将A、B、C型定为p1样、spaP样或sr样、pac样;D型只有1株临床株,不排除实验过程中突发变异的可能;E型的3株也为临床株,尚无参考株与其相对应。结论:变形链球菌(血清c、f型)表面蛋白可变区呈多态性分布,有5种基因型,分布较为集中者分别为p1样、spaP或sr样、pac样,且血清f型属于血清c型的spaP样。     

变形链球菌母子传播与其对牙面初始粘附关系的研究

目的:探索变形链球菌母子传播与其对牙面初始粘附能力的关系。方法:首先以AP-PCR检测Mutans streptococci(MS)在20对3~4岁儿童和母亲之间的传播,并从母亲口腔中筛选出传播株和非传播株;再采用同位素标记法,检测传播株和非传播株对SHA的粘附差异,同时对其表面蛋白粘附功能区spap-a和spap-pv分别用限制性内切酶haeⅢ和AluⅠ进行RFLP分析。结果:传播株较非传播株具有较弱的粘附力(P<0.01),spap-a和spap-pv经酶切后分别呈现的3种和2种基因型在传播和非传播人群的MS中分布不同(P<0.01)。结论:初始粘附能力弱的菌株被传播的可能性较大,不同MS株传播能力的差异可能与其表面蛋白A区,PV区的基因多态性有关。     

不同血清型变形链球菌表面蛋白可变区(extended-V)的同源性分析

目的 分析不同血清型变形链球菌表面蛋白可变区（extended-V）的基因及蛋白质的同源性,探讨该区在防龋疫苗研制中的作用。方法 以变形链球菌血清型c、d、f、g参考株及部分c型临床株为模板,PCR扩增SrV+区片段,通过内切酶DdeⅠ进行限制性片段长度多态性分析并测序,将其测序结果在NCBI服务器上用blastn搜索软件进行同源性比较。结果 在相同条件下血清c、f型菌株均扩增出约1.13 kb左右的片段,酶切后出现5种基因型（A、B、C、D、E）。选取所占比例较多的A、B、C型代表株进行测序,经比较显示其基因型间的同源性达92%-98%。血清d、g型无扩增产物,将g型6715表面蛋白SpaA全片段基因同OMZ175的产物序列在blastn上进行比较,有3个大小不一的片段出现同源性;血清d型OMZ176的表面蛋白基因序列在GeneBank上未能查出,故无法比较,但其相应蛋白质的同源性也在77%-82%之间,显示出相当高的同源性。结论 就c、f型菌株来说,可以将该区纳入疫苗的研究范畴;d、g型虽未能扩增出相应产物,但其基因还是存在部分区域的相似性,且其蛋白质同源性很高,也可以考虑利用d、g型上同c、f型共有的某些肽段进行疫苗的研制。     

变形链球菌临床株质子移位膜ATP酶γ亚基基因uncG遗传多态性及mRNA表达水平的研究

目的研究变形链球菌临床分离株质子移位膜ATP酶（F- ATPase）的γ亚基基因uncG的遗传多态性和mRNA表达水平。方法选取在不同龋敏感人群中分离的18株高耐酸和20株低耐酸变形链球菌为实验株,扩增uncG基因,行限制性内切酶长度多态性（RFLP）分析和测序比较,应用RT- PCR法和凝胶成像系统定量软件对20株不同基因型和不同耐酸力变形链球菌uncG基因的mRNA表达水平进行评价和比较。结果ALuⅠ- RFLP和BsrⅠ-RFLP产生A、B、C、D 4种基因型,但4种基因型在不同耐酸力菌株的分布差异没有统计学意义（P>0.05）。不同基因型及不同耐酸力菌株uncG的mRNA表达水平不同,但其差异也没有统计学意义（P>0.05）。结论变形链球菌F- ATPase γ亚基基因uncG的RFLP基因型和mRNA表达水平具有明显遗传异质性,但对菌株耐酸力没有明显影响。     

葡萄糖浓度对变形链球菌spaP基因表达的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖对变形链球菌初始粘附相关基因spaP表达的影响.方法 变形链球菌分别在0.2、1.0、5.0%葡萄糖条件下培养,提取总RNA,逆转录成cDNA,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测不同环境条件下变形链球菌初始粘附相关基因spaP的表达情况.结果 在0.2%～5.0%葡萄糖浓度范围内,粘附较强的变形链球菌菌株spaP基因的表达随糖浓度的增加而明显增强,粘附较弱的菌株也呈现这样的趋势,但差异不具有统计学意义.粘附较强的变形链球菌菌株其spaP基因的表达总体上高于粘附较弱的菌株.结论 在一定浓度范围内(0.2%～5.0%),葡萄糖浓度升高利于变形链球菌spaP基因表达可能是其促进变形链球菌初始粘附的机制之一;变形链球菌对牙面的粘附力可能与其spaP表达量有关.     

高龋及无龋者变形链球菌临床分离株致龋性研究Ⅰ对唾液包被羟磷灰石的粘附实验

目的：探讨来自不同龋敏感者的变形链球菌（血清型ｃ）临床分离株的粘附能力。方法：采用液体闪烁计测法测量＾３Ｈ－ＴＤＲ标记的变形链球菌临床分离株对唾液包被羟磷灰石（ＳＨＡ）的粘附。结果：同一个体所带不同基因型菌株对ＳＨＡ粘附量差异较大;高龋组个体定植的粘附能力强的菌株所占比较显著高于无龋组。结论：高龋组变形链球菌（血清型ｃ）临床菌株的高致龋力与其携带有粘附能力强的菌株密切相关。     

随机引物PCR法在变形链球菌基因分型中的初步应用

目的：研究利用随机引物PCR法来对口腔变形链球菌进行基因分型。方法：采用两组针对变形链球菌的随机引物，于不同的反应体系中，对变形链球菌群(血清型c、e、f、d、g)及3个临床分离株进行PCR扩增，并对变形链球菌的电泳图谱进行分析，鉴定其基因型的多态性。结果：运用两组随机引物均可鉴别不同血清型的变形链球菌，对同一血清型的链球菌还可鉴别其不同的基因型。结论：两组随机引物均能对变形链球菌进行基因分型。随机引物PCR法简便、快速、分辨率较高，是鉴定变形链球菌基因型的有效方法。     

变形链球菌基因转化相关DNA片段的初步研究

目的 :研究与变链菌基因转化相关的cslA基因在临床分离株中的检出情况。方法 :实验菌株源自前期工作所获得的不同黏附力及合成IG能力的变链菌临床分离株 ,提取全菌DNA并鉴定浓度和纯度 ,PCR扩增cslA基因 ,10g/L琼脂糖电泳观察结果。结果 :6 6株变链菌临床分离株中有 5 2株扩增出cslA基因 ,检出率为 79%。cslA基因的检出率在不同黏附力及合成IG能力的菌株间无统计学差异 (P >0 .0 5 )。结论 :cslA基因在变链菌临床分离株中的分布较广泛 ;尚不能认为cslA基因在毒力不同的菌株间的分布不同。     

老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株耐酸能力的研究

目的:分析老年人高龋患者牙菌斑中,变形链球菌临床分离株(血清型C)在酸性条件下生存的耐酸能力。方法:体外培养从老年人高龋患者、无龋者牙菌斑中分离的101种不同基因型变形链球菌株临床分离株(血清型C),检测菌株在不同的pH条件下的耐酸能力。结果:老年人高龋患者口腔中分离出的变形链球菌临床分离株耐酸能力明显高于无龋组,与国际参考菌株无明显的统计学差异。同时研究发现,在老年人高龋患者同一个体的口腔中,变形链球菌临床分离株耐酸能力存在明显差异。结论:老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株(血清型C)的高致龋性,与其携带有耐酸能力强的菌株关系密切。     

老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株合成胞外多糖能力的研究

目的；探讨老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌（血清C型）临床分离株合成胞外多糖能力。方法：收集老年人高龋患者、无龋者牙菌斑中变形链球菌（血清C型），检测合成胞外多糖能力，并与国际参考菌株比较。结果：老年人高龋患者牙菌斑中分离出的变形链球菌临床分离株合成胞外多糖能力明显高于无龋组。同时研究发现，在老年人高龋患者同一个体牙菌斑中，不同基因型变形链球菌临床分离株合成胞外多糖的能力仔任差异，在无龋者牙菌斑中发现没有这一现象。结论：老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌（血清C型）临床分离株合成胞外多糖能力强的菌株与龋病的发生密切有关。     

高龋者口腔中c血清型变形链球菌的基因组指纹分析

目的：确定高龋者口腔中c血清型变形链球菌的基因型分布。方法：从20例高龋者口腔中分离出c血清型变形链球菌，采用chelex法提取细菌染色体DNA，通过AP—PCR进行临床分离株的基因组指纹分析。结果：共分离获得了87株c血清型变形链球菌，不同个体所携带的变形链球菌临床分离株的基因型不同，同一个体可携带不同基因型的c血清型变形链球菌，26．7％的高龋者携带1种基因型，60．0％携带2种基因型，13．3％携带3种基因型。结论：大多数高龋者口腔中定植有2种或2种以上基因型c血清型变形链球菌。     

变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系

目的:探讨变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系。方法:取本课题组前期工作所获得的变链c型临床株,分成水溶性葡聚糖(W SG)组和水不溶性葡聚糖(W IG)组;每组又按葡聚糖合成能力分为合成量高(ABS>0.3)与合成量低(ABS<0.15)组。以所选细菌DNA为模板,PCR扩增表面蛋白V区编码基因SrV ,经DdeI酶切分型,比较各基因型在两组细菌中的分布情况。结果:1)两组均有4种基因型(A、B、C、D)并且在构成比上都以A、B型占多数,C、D型所占比例较少且存在明显差异;2)在W SG组主要基因型的分布出现差异:合成量高的以A型为主占50%,B型占33.33%,C型占11.11%;合成量低的以B型为主占50%,A型占30.77%,C型19.15%。3)在W IG组A、B型的分配基本相似,均在40~48%之间。结论:变形链球菌表面蛋白可变区的基因型分布与水溶性葡聚糖的合成存在一定的相关性而与水不溶性葡聚糖的合成未见明显关联。