人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体2)基因片段.序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同.将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c(+)上,构建表达质粒pET-28c(+)TRAIL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得表达菌株BL-pET-28c(+)TRAIL.表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导表达4h后,产生大量的重组人TRAIL蛋白,SDS-PAGE扫描计算机灰度分析表明,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40%以上.     

大肠杆菌caiAB基因的克隆与表达

从E.coli MC4100菌株的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码豆甜菜碱还原酶和L－肉碱脱水酶的caiAB基因片段，并经序列分析验证。由重组质粒pZJD-1480亚克隆得到pT7-A以及pT7-B重组表达质粒，后者转入E.coli BL21(DE3)菌株中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）上分子质量为40ku附近可见明显的表达蛋白带。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

LZ-8基因在大肠杆菌中的表达

根据Murasugi等人发表的ZL－8基因的DNA序列，设计了两条引物，从灵芝孢子粉的基因组DNA中扩增到LZ－8基因（356bp）。利用此基因及pET-3d质粒，构建了该基因的原核表达 载体质粒，进一步将其转化进大肠杆菌HB1010菌株中获得了表达该基因的基因工程菌株，并对IPTG诱导后的LZ－8蛋白进行了初步的SDS－PAGE分析。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)Cag致病岛(Cag-PAI)编码的Cag3(hp0522)基因重组质粒,转入大肠杆菌中表达,纯化重组蛋白.方法 以Hp 11637基因组为模板,应用PCR技术扩增Cag3基因片段,克隆至pGEM-T载体中测序,然后克隆到高效表达载体pET-28a(+)上,得到了重组表达载体pET-28a(+)-Cag3,转化表达宿主菌大肠埃希菌BL21;经IPTG诱导表达后,将大量表达的重组蛋白用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化;采用串联飞行时间质谱技术对Cag3-His融合蛋白进行鉴定.结果 成功克隆了Cag3基因.经SDS-PAGE分析,表达蛋白相对分子质量与预期大小一致;质谱检测到Cag3重组蛋白的表达.结论 成功构建了Cag3基因的原核表达载体pET-28a(+)-Cag3.     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

人胰岛素样生长因子—1在大肠杆菌中的表达

为获得大量的人胰岛素样生长因子-1（human Insulin-like Growth Factor-1,hIGF-1)产品,构建了hIGF-1原核表达系统。设计引物,引入Nde I和Hind Ⅲ酶切位点,以人工合成构建的pUCIGF质粒为模板,CR扩增hIGF-1基因。酶切后,克隆于原核表达载体pRSET B中,构建pRSET-IGF重组质粒,转化入肠杆菌BL21（DE3）进行表达。带有重组质粒pRSET-IGF的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明：可表达出相对分子质量78000的蛋白,重组蛋白以非融合、可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白量的10%～20%,Western印记表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原活性。构建的pRSET-IGF重组质粒成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中高效可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCU C端截短21个氨基酸的.NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件.利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a( )-NSSB-C21,IFTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定.成功构建了HCV NSSB蛋白表达载体pET-28a( )-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5D-C21表达产物的可溶性明显增加.HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础.     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

白细胞相关免疫球蛋白样受体-2的克隆、原核表达及纯化

以人白细胞相关免疫球蛋白样受体-2 (LAIR-2/CD306) cDNA质粒为模板,通过PCR技术获得该蛋白成熟区基因片段,插入表达载体pET28a的多克隆位点,进而将构建的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,所得重组蛋白以包涵体形式存在,包涵体经变性、复性及亲合色谱分离后获得重组蛋白.     

人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定

构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121Ⅱ的重组原核表达质粒,获得hVEGF121Ⅱ蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术,在已构建的hVEGF121Ⅰ突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407-426两段串联重复序列的编码基因,PCR产物经Hind III和Nco I双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,乳糖诱导表达,超声破碎菌体,包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ,Western-blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121Ⅱ蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121Ⅱ,重组菌株经乳糖诱导后,目的蛋白表达量占全菌蛋白的62%,分离纯化后纯度达到95%,hVEGF121Ⅱ蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVEGF121Ⅱ蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。     

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。     

GP73 融合蛋白原核表达及纯化

目的：原核表达并纯化高尔基体糖蛋白-73（GolgiProtein73,GP73）。方法以人肝癌细胞系HepG2总RNA为模板,经RT-PCR扩增GP73基因,克隆至原核表达载体pET-21a（＋）-TRX中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。His-tag磁珠纯化重组蛋白GP73,SDS-PAGE鉴定。结果克隆目的基因的序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）-TRX-GP73经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD,与预期相符。结论本实验成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了GP73重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Balb／C小鼠金属硫蛋白—1基因在大肠杆菌中的高效表达

将Balb/C小鼠金属硫蛋白－1基因克隆于质粒表达载体pET-21a上,克隆采用限制性内切酶BamH1与EcoR1酶切pET21a及金属硫蛋白－1基因PCR产物,连接成pET21a-MT重组质粒,并将其转化进入大肠杆菌表达受体菌BL21（DE3）中,经异丙基－β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）证实产生高效表达金属硫蛋白－1基因的金属硫蛋白融合蛋白。表达蛋白在胞内主要以不溶性包涵体存在。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建

目的对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因片段进行扩增表达,纯化及鉴定。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得编码PBP2a转肽酶区的mecA基因片段,将此目的基因片段与pET-21a(+)载体连接,构建pET-21a(+)-mecA的重组质粒,经双酶切、测序正确后,将重组质粒转入E.coli BL21 DE3中,用IPTG诱导mecA融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果构建了mecA基因的原核表达载体,并获得高效表达。结论获得了mecA基因编码的PBP2a蛋白,为MRSA的耐药机制、药物治疗等进一步研究奠定了基础。     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

人sTRAIL基因的克隆、表达纯化及对人A549细胞的抗肿瘤活性作用

目的人TRAIL基因胞外区片段(114-281氨基酸残基,sTRAIL)的克隆、表达、纯化及对人肺腺癌A549细胞的抗肿瘤活性研究。方法采用PCR技术从人胎盘和肺cD-NA文库中扩增出全长人TRAIL基因,克隆到pUC19质粒载体上进行测序。然后再采用PCR技术,以全长人TRAIL基因为模板,扩增出sTRAIL基因片段并定向克隆到pET-11 a表达载体中,转化大肠杆菌BL21进行表达。表达后的产物经变性、复性和分离纯化,纯化后的sTRAIL用结晶紫染色法和流式细胞仪法测定其对人肺癌细胞A549的细胞毒性作用。结果从人胎盘和肺cDNA文库中都能扩增出全长人TRAIL基因,经测序表明与已发表的人TRAIL基因序列一致。扩增出的人sTRAIL基因克隆到表达质粒载体pET-11a,经IPTG诱导表达,表达量占细菌全菌蛋白的50%,纯化后的sTRAIL纯度大于98%,结晶紫法测定对人A549肺癌细胞的细胞毒性作用的IC50为(24±5.2)μg.L-1,流式细胞仪法测定对人A549肺癌细胞的细胞毒性具有明显的效应-时间依赖关系。结论本实验成功地克隆了人sTRAIL基因并实现其高表达,摸索出包涵体sTRAIL的变性、复性及其纯化方法,纯化后的sTRAIL蛋白对人A549肺癌细胞具有明显的细胞毒性作用,为进一步研究其功能与临床应用奠定了基础。     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。