河北省HIV-1流行株的env基因序列测定和亚型分析

目的了解河北省HIV-1亚型的分布特点和传播方式,推测流行时间,预测流行趋势。方法采集HIV感染者的全血样品,分离外周血单核细胞(PBMC),提取前病毒DNA,使用套式聚合酶链反应(nested-PCR),扩增HIV-1的env基因的C2-V3区并进行序列测定和亚型分析。结果对22份HIV-1感染者的样品,扩增得到了18份HIV-1envC2-V3基因片段,经序列测定和基因分析鉴定出3种HIV-1M亚群基因亚型,即:B′、CRF-BC和C亚型。B′亚型的组内基因离散率为7.84%±3.14%(n=14),基因序列与云南瑞丽株rl42(泰国B亚型)相近;2株CRF-BC亚型与广西毒株的基因离散率为4.60%。与血液途径感染有关的人员均为B′(泰国B)亚型。结论目前,在河北省发现了3种HIV-1亚型。输供血途径中B′亚型仍是主要的流行亚型,可能来源于云南吸毒人群。HIV-1B′亚型在河北省的流行时间大约为7~9年。     

湖北省HIV-1流行株gag基因序列测定及亚型分析

目的 了解湖北省HIV-1感染者流行毒株亚型分布和流行趋势.方法 随机采集湖北省HIV-1感染者的抗凝全血标本,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链反应扩增HIV-1病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 对80份HIV-1感染者的样品进行扩增,得到了62份样品的HIV-1基因片段.共发现7种HIV-1亚型和流行重组株.泰国B'亚型占11.3％ (7/62),欧美B亚型占4.8％ (3/62),G亚型占4.8％ (3/62),CRF07-BC占22.6％ (14/62),CRF08-BC占6.5％(4/62),CRF01-AE占48.4％(30/62),CRF15-01B占1.6％ (1/62).在湖北省发现了CRF15-01B和G亚型.结论 湖北省存在多种HIV-1亚型和流行重组型,CRF01-AE、CRF07-BC两种重组亚型毒株为目前湖北省HIV-1流行优势毒株,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略.     

HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列分析及表型预测

目的 克隆并分析HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列,根据其氨基酸序列进行表型预测,为疫苗的抗原设计奠定基础.方法 采集北京地区HIV-1 B/C重组型的抗凝全血标本,分离血浆和提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增rev-env基因,对扩增产物进行序列测定.根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列,并对重要的Env功能结构域进行深入的分析和比较.结果 从12例B/C重组型HIV-1感染者中成功克隆到7个rev-env基因,序列分析发现其中6个有完整的开放读码框（ORF）,全部为CRF_07B/C重组型.6个Env蛋白氨基酸N糖基化位点和数目没有显著变化;CD4受体结合位点高度保守;根据V3环氨基酸序列及静电荷数目预测全部使用CCR5辅助受体;GP120/GP41剪切位点高度保守,预测所有GP160前体都能有效剪切;对几个已知中和抗体的中和位点分析推测全部的6个序列都对2G12、2F5中和不敏感;对4E10、PG9及PG16中和敏感.结论 有必要进一步阐明env基因型与相关功能的关系,这将为疫苗和药物研究提供依据.     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出，插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染φNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

中国HIV-1型B、C亚型主要流行株外膜蛋白基因V3-V4区序列的变异分析

目的　研究我国人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)B、C亚型主要流行株在感染过程中基因变异的特点及其与选择压力的关系。方法　应用巢式聚合酶链反应 (nested PCR)对 2 5 8例HIV 1感染者血样中的HIV 1外膜蛋白 (env)基因进行扩增 ,并使用ABI 377型测序仪对扩增产物测序后 ,选择其中 37份B亚型和 35份C亚型HIV 1毒株env基因包括V3～V4区的序列进行比较分析 ,并计算和分析氨基酸同义替换与非同义替换的比值 (Ks Ka)。结果　B亚型毒株V3～V4区的基因离散率高于C亚型毒株。无论B亚型 ,还是C亚型毒株 ,其V4区基因序列较V3区变异更大。在C亚型毒株中 ,V3区基因序列变异甚至比V3上游区和C3区小。B和C亚型毒株整个V3～V4基因区的Ks Ka比值均 <1,差异有非常显著性 (P <0 0 0 1) ,其中B亚型毒株以V3区的Ks Ka比值最小 ,而C亚型毒株则以V4区的Ks Ka比值最小。结论　B和C亚型毒株env基因的变异主要发生在V4区而不是V3区。C亚型毒株V3区较V3上游区和C3区还要保守 ,是本研究的特殊发现。这两种亚型在我国快速流行中发生的变异是在选择压力下发生的 ,而不是随机进化的结果 ,而且选择压力对这两种亚型毒株V3、V4区的作用程度也不一样。这将为我国艾滋病防治策略的制定和疫苗研究提供科学的依据。     

河南省分离的HIV-1 B-Thai亚型流行株全基因组克隆及序列分析

目的 克隆、鉴定自河南省分离的HIV-1 B-Thai亚型流行株并进行系统发育分析。方法收集河南省1份HIV-1感染者全血后分离的淋巴细胞，在植物血凝素存在下与健康献血员淋巴细胞共培养，从培养的淋巴细胞中提取前病毒DNA。在HIV-1基因的长末端重复序列的保守区设计引物，利用LA Tag长链扩增系统扩增HIV-1全长基因，纯化的PCR产物与pWSK29-T载体连接，成功克隆CNHN24株。对鉴定的3个克隆进行全长测序，利用局部同源法计算同源率，同时采用Phylip软件绘制HIV-1 Env、Gag和Pol基因的进化树。结果 V3V4环序列分析表明：本次克隆的CNHN24株病毒为HIV-1 B-Thai亚型，V3环区氨基酸序列比对发现在9个位点发生氨基酸替换。在含有9010bp，全长HIV-1基因的CNHN24株克隆中未发现明显的缺失、插入和重排现象，Gag、Pol、Vpr和Vif基因与RL42株的同源率达到95．42％～97．08％，进化分析显示，CNHN24株与RL42株的遗传距离最近。结论 HIV-1 CNHN24株为国内实验室完成的HIV-1全长基因克隆，为进一步研究HIV-1流行特征提供了基础。     

重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达

目的 构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使CD4 T淋巴细胞C8166内源性的高表达Vpr蛋白.方法 利用AdEasy-1系统, 通过将含有目的 基因片段的穿梭载体pAdTrack-CMV-vpr和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒Ad-vpr, 用脂质体法将重组质粒转染至HEK293A细胞包装, 获得重组腺病毒Ad-vpr, 荧光显微镜观察Ad-vpr感染C8166细胞GFP的表达 , Western blotting鉴定Vpr在C8166细胞内的特异性表达,流式细胞术检测Ad-vpr感染 C8166细胞的效率.结果 成功构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒 ,Western blotting结果表明重组腺病毒Ad-vpr感染的C8166细胞内源性的高表达Vpr 蛋白,流式细胞术检测结果表明Ad-vpr感染C8166细胞效率高(44.07±3.62)%.结论 成功构建出携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白.     

HIV-1 Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：在E．coli BL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法：用PCR方法构建HIV-1 Tat基因全序列，同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG，AAG50替换为CAG)，以消除天然．Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后，共同亚克隆人表达载体pET28a中，并在Ecoli中表达，表达产物用Western blot进行鉴定。结果：分别通过3轮PCR，成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a-chap10-Tat在Ecoli BL21(DE3)中得到高效表达。Western blot分析表明，在相对分子质量(Mr)为24000处有1条特异性的带。结论：chap10基因与HIV-1 Tat全基因的融合构建，使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。     

江西省部分吸毒人群HIV-1分子流行病学调查

目的对江西省吸毒人群进行HIV-1分子流行病学调查研究,了解HIV-1流行情况、亚型种类、毒株来源、变异情况等,为政府部门制定预防控制决策提供技术资料。方法传统流行病学与分子流行病学相结合,对江西省9例吸毒人员进行流行病相关因素分析和基因序列、系统进化分析。结果江西省部分吸毒人群不仅共用注射器,同时伴有不洁性交史。流行毒株主要为HIV-1 CRF01-AE,序列分析表明与越南和我国广西吸毒人群流行毒株相似性较高,与越南株U90087平均基因距离为9.00±2.27。系统进化分析表明,江西省吸毒人群的毒株来源完全一致。结论目前江西省吸毒人群中HIV流行已从局部向全省蔓延,流行毒株为HIV-1CRF01-AE。为阻止蔓延,应加强对吸毒人群和性乱人群的行为干预。     

云南省陇川县HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和分析

使用ＰＣＲ对２１份采集于１９９５年中的云南陇川县ＨＩＶ－１阳性静脉吸毒者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增，从１７份样品中获得了ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段，并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。研究结果表明，１７份陇川样品中存在Ｂ和Ｃ两种亚型的ＨＩＶ－１毒株序列，各亚型内的基因离散率分别为４．７％和３．３％。与Ａ～Ｅ参考亚型及部分Ｂ和Ｃ亚型代表株序列相比较，属陇川Ｂ亚型的１４个毒株与包括泰国、缅甸及云南瑞丽在内的Ｂ亚型毒株序列十分接近，基因离散率在３．９％～４．５％的范围内；属陇川Ｃ亚型的３个毒株则与代表印度毒株的Ｃ亚型共享序列及瑞丽Ｃ亚型毒株序列十分相似，其基因离散率均为２．５％。以上数据提示，ＨＩＶ－１在陇川的流行时间不长，且Ｂ和Ｃ亚型毒株的传入时间相差１年左右。对Ｂ亚型毒株Ｖ３环序列的分析还发现，位于Ｖ３环顶端的四肽序列中ＧＰＧＱ占６４．３％，ＧＰＧＲ则仅占２８．６％，且编码其精氨酸（Ｒ）的密码子均为ＣＧＡ而不是ＡＧＡ。此结果与作者根据早期瑞丽ＨＩＶ－１毒株序列研究结果得出的推测相吻合。     

我国HIV-1 B''亚型毒株gag基因变异特征研究

目的研究我国人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B’亚型主要流行株在宿主免疫压力下的基因变异及抗原表位的变化特征，探讨选择压力、基因离散率和抗原表位变化之间的关系。方法从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增后，将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析，使用GCG软件包的Distance程序对P17和P24两个区段计算基因距离，用Diverge程序计算同义替换（1（s）和非同义替换（1（a）及二者之间的比值，并对我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况进行分析。结果HIV-1B’亚型毒株的P17区段的Ks／Ka值〈1，而P24区段的Ks／Ka值〉1；P24部分的基因离散率低于P17部分；P17区段抗原表位的保守率为34．94％，而P24区段抗原表位的保守率为67．38％；从基因离散率、所受的选择压力及抗原表位的突变率3个方面来看，HIV-1的P17区段均明显大于P24区段。结论HIV-1B’亚型毒株的P17区段的抗原表位变化较大，而P24区段的抗原表位相对较为保守。提示P24区段的CTL表位更适合于表位疫苗的研制。     

黑龙江省17例HIV/AIDS患者的病毒亚型及基因序列特征分析

目的了解黑龙江省内部分人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的亚型及基因序列特征。方法用巢式聚合酶链反应（nested-PCR），对黑龙江省内17份HIV-1感染者外周血单个核细胞（PBMC）中前病毒脱氧核糖核酸的膜蛋白（env）基因进行扩增，并对C2-V3的核苷酸序列进行测定和分析。结果系统树分析显示，17份样本中病毒与HIV泰国B（B’）亚型聚在一起，基因离散率为（6．94±1．01）％，与欧美B亚型基因离散率为（12．94±2．19）％，与其他亚型的离散率大于20％。对于其V3环四肽序列的分析表明，具有GPGQ的8例，占47．06％；具有GPGR的7例，占41．18％；1例为GQGR；1例为GPGH。通过序列分析预测，大部分利用CCR5辅助受体。结论所检测的黑龙江省17例HIV-1均为B’亚型，提示黑龙江省的HIV-1流行株可能以B’亚型为主，其V3环顶端四肽序列特征以GPGQ和CP（承为主。     

广东省珠江三角洲地区吸毒者中流行的HIV-1 ENV基因序列分析

目的 了解广东省珠江三角洲地区吸毒者HIV-1亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性.方法 应用套式聚合酶链反应(PCR)对43例采自广东省珠江三角洲HIV-1抗体阳性的吸毒者淋巴细胞富集液,并对其核酸样品进行扩增,使用ABI377型测序仪对扩增产物测序后,对其ENV基因C2-V3段的核酸序列进行比较分析.结果 43份血样中,29份为07-BC重组亚型,与国际参考株CN.97.C54A最近,基因离散率为(2.291±1.055)%,组内离散率为(3.534±1.306)%;9份为AE重组亚型,与国际参考株01AE.TH.90.CM240最近,基因离散率为(8.068±0.534)%,组内离散率为(2.823±1.235)%;3份为08-BC重组亚型,与国际参考株97CNGX-9F最近,基因离散率为(1.403±0.681)%,组内离散率为(1.507±0.681)%;2份为泰国B(B')亚型,与国际参考株RL42最近,基因离散率为(7.335±3.330)%,组内距离为8.52%.结论 广东省珠江三角洲地区吸毒者感染的HIV-1以曾经主要在西北地区吸毒人群中流行的07-BC重组亚型为主,也存在主要以性传播途径感染的人群中流行的AE重组亚型,提示珠江三角洲地区吸毒者中流行的HIV-1亚型趋于多样化.     

Construction and identification of recombinant lentiviral vector containing HIV-1 Tat gene and its expression in 293T cells

Objective

To construct a lentiviral vector expressing HIV-1 Tat and identify its expression in 293T cells.

Methods

The gene fragment of HIV-1 Tat₁₀₁ was subcloned to lentiviral transfer vector pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen, which was named pHAGE-Tat. Then the constructed pHAGE-Tat was used to co-transfect the packing 293T cells, together with the packaging plasmids pMD2.G and psPAX2. The packaged viral particles designated LV-Tat were used to infect the 293T cells and the viral titer was calculated. The expression of HIV-1 Tat in 293T cells was confirmed using RT-PCR and western blot.

Results

The recombinant lentiviral vector was successfully constructed and could express HIV-1 Tat in 293T cells. The virus titer was 5.73×10⁶ ifu/ml.

Conclusion

The successfully constructed recombinant lentiviral vector makes a strong foundation for further exploring the possible role of HIV-1 Tat in the development of prostate cancer.     

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4 、CD8 T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。