凋亡相关基因Bax和bcl-2在骨关节炎软骨中的作用

目的探讨原发性骨关节炎与继发性骨关节炎发病机制的异同。方法收集原发性骨关节炎、继发性骨关节炎的关节软骨各8例，并以9例正常关节软骨作对照，采用RT—PCR和免疫组化方法分别检测Bax和bcl-2的mRNA和蛋白的表达，应用细胞核荧光染色的方法进行软骨细胞凋亡的检测。结果1．原发性骨关节炎组BaxmRNA表达明显升高，与继发组、对照组差异均有统计学意义（P〈0．01，P〈0．01），而继发性骨关节炎组Bax mRNA的表达与对照组之间的差异没有统计学意义（P〉0．05）；bcl-2mRNA在两类骨关节炎中的表达较对照组均升高（P〈0．01，P〈0．05），而两组间差异没有统计学意义（P〉0．05）。2．免疫组化发现两类骨关节炎中Bax、bcl-2蛋白表达水平与其mRNA表达相一致。3．原发性骨关节炎组、继发性骨关节炎组和正常对照组细胞凋亡率分别为10％～20％，8％～13％，2％～5％。原发性骨关节炎组细胞凋亡比例最高。结论软骨细胞凋亡是骨关节炎发病的重要原因，受Bax和bcl-2的共同调节；Bax表达水平的升高可能是原发性骨关节炎发病的重要原因。     

人原发性骨关节炎与正常人关节软骨间充质祖细胞多向分化能力的对比研究

[目的]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,探讨关节软骨间充质祖细胞在原发性骨关节炎发病中的重要作用。[方法]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨(微团培养)诱导分化后的细胞形态变化,TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色,GAG含量及Ⅱ型胶原mRNA表达;成骨(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,钙结节染色,ALP活性及BGPmRNA表达;成脂(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,油红染色,油红染色阳性细胞比率及TG含量。[结果]原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨诱导分化后细胞TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色均呈阳性,原发性骨关节炎者GAG含量减少及Ⅱ型胶原mRNA表达减弱(P<0.05);成骨诱导分化后细胞钙结节染色均呈阳性,原发性骨关节炎者ALP含量减少及BGPmRNA表达减弱(P<0.05);成脂诱导分化后细胞油红染色均呈阳性,原发性骨关节炎者TG含量增加(P<0.05)。[结论]关节软骨间充质祖细胞经成软骨、成骨及成脂诱导后均能分化为具有相应功能细胞特性的分化细胞。原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞成软骨和成骨分化能力降低,而成脂分化能力增加,提示原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞分化功能出现异常,骨关节炎关节软骨细胞对软骨损伤修复能力降低。     

骨炎定方对一氧化氮抑制人骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响

[目的]观察骨炎定方对一氧化氮抑制离体人骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响,探讨中医药补肾益气行血法保护软骨细胞的作用途径.[方法]髋关节炎行关节置换术中获取离体股骨头关节软骨,行软骨细胞分离培养传代,通过设立空白血清对照组,IL-1组、IL-1加NAME组、补肾益气行血法中药骨炎定方含药血清组加入传代软骨细胞,采用MTT法于不同时间测定软骨细胞增殖影响,并运用逆转录聚合酶链技术检测对软骨细胞一氧化氮合酶（iNOS）和Ⅱ型胶原mRNA的影响.[结果]骨炎定方含药血清组在不同时间段均有促进软骨细胞增殖的作用.和对照组相比,3组（IL-1组、IL-1加NAME组、IL-1＋骨炎定方含药血清组）均明显了增加iNOS mRNA的表达,但加入NAME组及骨炎定方含药血清组和IL-1组相比,可以抑制iNOS mRNA的表达,和IL-1组相比,有明显的差异性（P〈0.05）.和IL-1组相比,3组（对照组、IL-1加NAME组、IL-1＋骨炎定方含药血清组）均明显增加了Ⅱ型胶原mRNA的表达,但各组间无差异（P〉0.05）.培养细胞上清液中亚硝酸盐含量测定显示：关节软骨细胞几乎不产生NO,但在IL-1刺激下可产生NO,而加入NO合酶抑制剂NAME后,可部分抑制NO产生,骨炎定方含药血清组也显示出可以部分抑制NO的产生,其作用与NO合酶抑制剂NAME统计学处理没有明显差异.[结论]骨炎定方可以促进人软骨细胞增殖、能抑制iNOS的表达,增加Ⅱ型胶原的表达,这种作用与使用一氧化氮合酶抑制剂得出的结果没有明显差异,可能是中医药补肾益气行血法保护软骨细胞作用途径之一.     

生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究

[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达最为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.     

不同状态软骨细胞在共培养系统下对BMSCs向软骨细胞诱导分化作用的研究

[目的]观察不同代次正常软骨细胞和关节炎软骨细胞对琼脂糖-BMSCs向软骨细胞分化的促进作用.[方法]分离新西兰兔BMSCs,正常软骨细胞.制作兔关节炎模型,提取兔关节炎软骨细胞.将BMSCs和低熔点琼脂糖复合成凝胶块,放在自制的六孔板网格架上,构建兔软骨细胞-BMCSs共培养系统.在3、7、14 d取各组琼脂精BMSCs凝胶块进行实时定量PCR、GAG含量检测.[结果]兔关节炎模型制作成功,关节面色泽较灰暗,关节软骨粗糙.Normal PO-BMSCs组的Ⅱ型胶原基因表达明显增强,Normal P3-BMSCs组Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达均未见明显增强,OA PO-BMSCs组蛋白聚糖基因表达明显增强,OA P3-BMSCs组Ⅰ型胶原基因表达水平在3个时间点均低于对照组.Normal PO-BMSCs组的GAG含量为5.7±0.49μg/mg(湿重),较对照组有明显上升.OA PO BMSCs组GAG含量与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),其余三组与对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05).[结论]兔正常PO软骨细胞与兔关节炎PO软骨细胞所分泌的形态发生素能够有效促进BMSCs向软骨细胞分化,而兔正常P3软骨细胞的促分化作用微弱,兔关节炎P3软骨细胞不能促进BMSCs向软骨细胞分化.     

复合材料置入软骨下骨诱发兔膝骨关节炎的实验研究

[目的]通过增加软骨下骨硬度模拟软骨下骨硬化,诱发骨关节炎的发生,探讨骨关节炎发病机制.[方法]调整聚甲基丙烯酸甲酯粉剂(polymethylmethacrylate,PMMA)、甲基丙烯酸甲酯液剂(methylmethacrylate,MMA)、羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)和蒸馏水的比例,使反应温度低于40℃,测量该比例下聚合后的极限强度和刚度并与软骨下骨比较,制得PMMA/HA复合材料.刮除兔胫骨平台内侧软骨下骨后置入复合材料,对术后3、6、9、12周的关节软骨进行组织学观察,免疫组化法榆测Ⅱ型胶原和基质会属蛋白酶-1(matrix metallo proteinase-1,MMP-1)在软骨中的表达和分布,并与空白、对照组比较.透射电镜观察空白、6、12周组软骨细胞改变.[结果]该复合材料置入软骨下骨后,随观察时间延长实验组逐渐出现退变,Mankin分级逐渐升高,电镜也显示实验组软骨细胞退变表现.免疫组化显示Ⅱ型胶原表达增加主要在移行层和深层上部,MMP-1表达以软骨表层及中上层居多,随观察时间延长二者染色强度均逐渐升高.[结论]增加软骨下骨硬度后,诱发了兔膝骨关节炎.提示软骨下骨硬化可引起软骨退变,其可能是骨关节炎的病因之一.     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

不同培养条件下脂肪干细胞与软骨细胞共培养的研究

探讨病理状态下软骨细胞能否诱导脂肪干细胞(ADSC)向软骨细胞分化以及可能的最佳条件,以便为临床修复关节软骨损伤提供可能的新途径.[方法]分离共培养新西兰大白兔骨关节炎模型的ADSC和软骨细胞,根据不同血清浓度(10% FBS和2% FBS)和不同培养空间(纤维蛋白凝胶支架和无支架单层培养)分组,共培养14 d后,胰酶消化终止.倒置显微镜观察和透射电镜观察共培养后ADSC的形态变化.甲苯胺蓝染色法和免疫细胞化学检测共培养后ADSC的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达水平.RT-PCR检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平.[结果]共培养7 d后部分ADSC变圆,14d时ADSC形态高度分化与成熟软骨细胞相似,其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高,尤以10%FBS支架共培养组最为明显.[结论]与病理状态下软骨细胞共培养后,ADSC可以被诱导成软骨样细胞.高浓度血清三维培养可以增强这种诱导作用.     

自噬在骨关节炎软骨细胞退变中表达的研究

目的:探究不同退变阶段骨关节炎自噬因子ULK1、Beclin1和LC3B在软骨细胞中的表达.方法:根据Kellgren-Lawrence影像学诊断标准,收集正常软骨样品,中期、晚期骨关节炎软骨样品;体外分离、培养软骨细胞,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色用于鉴定软骨细胞,运用荧光定量PCR及WB技术分别从mRNA及蛋白水...     

骨关节炎骨赘发生过程中的分子表达特征

目的探讨Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅹ型胶原以及氨基多糖等分子在骨关节炎骨赘发生过程中的表达特点。方法取全膝关节置换术中取下的原发性骨关节炎骨赘标本25例,男6例,女19例;平均年龄69.1岁。固定脱钙后制成石蜡切片,行HE和甲苯胺蓝染色了解基质含量、细胞数量和蛋白多糖的表达。采用S-P法进行Ⅰ型、Ⅱ型（Ⅱa和Ⅱb）、Ⅹ型胶原分子的免疫组化染色。结果根据骨赘中主要组织的细胞形态学和Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅹ型胶原以及氨基多糖分子的表达特点,共获得五种主要不同类型的骨赘组织。Ⅰ型组织主要含有间充质细胞表达的Ⅰ型胶原;Ⅱ型组织内出现了前软骨细胞分化,并表达Ⅱa型胶原和蛋白多糖;Ⅲ型组织表达Ⅱb型胶原及多量蛋白多糖,同时也表达Ⅰ型和Ⅱa型胶原;Ⅳ型组织的软骨细胞呈明显的带状分布,表达丰富的Ⅱb型胶原和蛋白多糖,深层的肥大软骨细胞表达Ⅹ型胶原;Ⅴ型组织的成分与正常关节软骨接近,主要表达Ⅱb型胶原及丰富的氨基多糖分子。这五种组织可能分别代表骨赘发生过程中的间充质细胞期、前软骨细胞期、软骨细胞期、早期骨赘期和成熟骨赘期。结论在骨关节炎骨赘发生的不同阶段,Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅹ型胶原分子以及氨基多糖分子存在特异的分化表达,据此可将骨赘的发生过程分期进行研究。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的研究

[目的]探讨SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的可行性,为临床修复关节软骨损伤寻找新途径.[方法] 分离、扩增新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)和软骨细胞,根据SPIO标记(50μg/ml)和不同培养环境(共培养、单独培养)分4组,每天在倒置显微镜观察共培养后BMSCs的形态变化,共培养14 d后,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,阿利新蓝法检测蛋白多糖(GAG)表达水平.[结果] 共培养7 d后标记的部分BMSCs变圆,14 d时BMSCs形态高度分化与成熟软骨细胞相似,其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高,明显优于对照组,差异具有显著性意义(P<0.01).[结论]1.软骨细胞微环境能有效诱导BMSCs向软骨细胞分化;2.SPIO可以安全、有效地标记BMSCs.     

骨关节炎软骨中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布

目的：研究骨关节炎软骨中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布。方法：从正常关节软骨和骨关节炎软骨上取样本做切片，所有样本行HE、蕃红0染色及Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化。结果：骨关节炎软骨中Ⅱ型胶原免疫组化染色不均匀。Ⅰ型胶原染色，在表层和中层的部分区域有不规则着色，纤维样组织中，Ⅰ型胶原免疫组化呈阳性，Ⅱ型胶原免疫组化不着色，结论：骨关节软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的破坏增强与软骨细胞对其合成增强同时存在，软骨修复的过程中，部分软骨细胞发生去分化，而表达Ⅰ型胶原。     

骨形态发生蛋白信号通路在骨关节炎发病机制中的作用研究

目的观察人膝关节不同退变阶段骨关节炎(OA)软骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)信号通路相关分子的表达变化情况。方法根据Kellgren-Lawrence(K-L)X线分级膝关节软骨分为正常组(O级)、中期OA组(Ⅲ级)和晚期OA组(Ⅳ级)。各组收集软骨标本6~8例,体外分离与培养软骨细胞,采用第2代软骨细胞进行检测。运用实时定量PCR技术及Western-Blot技术检测BMP信号通路相关分子及软骨细胞表型标记物的表达情况。运用SPSS 22.0(IBM,USA)软件进行统计分析,计量资料采用方差分析,组间比较采用SNK法。结果随着OA退变程度加重,BMP信号通路中激活素受体样激酶1(ALK 1)和TGF-β家族信号通路的下游信号分子Smad 1表达升高(F=33.6,P0.05;F=21.3,P0.05),人性别决定区Y框蛋白9(Sox 9)转录因子表达下降(F=21.0,P0.05),与正常软骨组比较均有统计学差异。而中期OA组与晚期OA组无统计差异(P0.05);Smad 7表达在各组间差异无统计学意义(P0.05)。随着OA退变程度加重,软骨细胞正常表型标记物Ⅱ型胶原表达降低(F=234.6,P0.05),而肥大分化表型标记物X型胶原及金属蛋白酶3表达则升高,各组间差异均有统计学意义(F=81.0,P0.05;F=29.8,P0.05)。结论在OA软骨细胞中,BMP信号通路相关分子高表达是软骨细胞退变及OA的进展的重要因素。     

兔骨关节炎模型中Wnt/β-catenin信号通路研究

目的:探讨兔骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达情况及其在骨关节炎中的作用。方法:采用改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型,分阶段酶消化法分离正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞。采用ELISA法检测正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中β连环蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-4(ADAMTS-4)、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、白细胞介素(IL)-1β、IL-18和IL-33的水平。结果:与正常对照组比较,骨关节炎组β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白水平均明显升高,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的蛋白水平均明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。与正常对照组比较,骨关节炎组IL-1β、IL-18和IL-33蛋白水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:兔骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路明显激活,介导软骨细胞外基质分解代谢、促进软骨破坏,而炎性因子IL-1β、IL-18和IL-33可能在此过程中并未起到关键作用。     

人参皂甙Rb1对体外软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响

目的:探讨兔体外软骨细胞不同代系间Ⅱ型胶原mRNA表达的差异以及人参皂甙Rb1对第2代软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。方法:在成功分离培养软骨细胞后,以细胞爬片法检测原代及第2、4代软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的差异。以浓度为0·01μmol·L-1,0·1μmol·L-1,1μmol·L-1,10μmol·L-1,100μmol·L-1的Rb1作用于贴壁3d后的第2代病理软骨细胞,观察各浓度组软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果:原代、第2代、第4代软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的强度依次下降,适宜浓度的Rb1可增强第2代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达,维持软骨细胞的正常表型。结论:兔软骨细胞不同代系间Ⅱ型胶原mRNA的表达存在一定差异,人参皂甙Rb1可能有利于第2代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。     

强力霉素对兔制动骨关节炎模型的治疗作用

[目的]探讨强力霉素对兔制动骨关节炎模型的治疗作用及其作用机制.[方法]新西兰大白兔24只,随机分为正常、模型、对照和治疗组,每组6 只.除正常组外,所有动物以石膏固定左下肢于伸直位4周.然后治疗组给予强力霉素口服治疗,4周后观察股骨内髁的退变情况,并检测软骨Ⅱ型胶原含量、尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)和基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMP)-13水平.[结果]治疗组软骨退变较模型和对照组明显减轻,模型与对照组之间Ⅱ型胶原含量、uPA和MMP-13的表达无统计学意义(P>0.05),其它各组均有显著统计学差异(P<0.01).uPA与MMP-13的表达呈正相关(r=0.973,P<0.05).[结论]强力霉素可抑制软骨退变,改善软骨结构.其作用与uPA、MMP-13的表达抑制有关.     

青少年特发性脊柱侧凸软骨Sox9表达及意义

[目的]检测Sox9及软骨特异性标记物Ⅱ型胶原及Aggrecan在青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis, AIS)患者关节突软骨细胞中的表达,探讨其与AIS发生、发展的关系。[方法]收集我院行后路脊柱侧凸矫形术的15例AIS患者的关节突软骨标本,设为AIS组;取同年龄段无脊柱侧凸行脊柱融合术的10例患者正常软骨标本,设为对照组。分别分离软骨细胞体外培养,分别采用RT-PCR,免疫组化,免疫荧光染色和Westen-blotting等方法检测AIS组及对照组软骨Sox9及Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达情况,进行两组间比较和AIS组凸侧与凹侧间比较。[结果] AIS组患者软骨细胞内的Sox9及软骨特异性标记物CollagenⅡ及Aggrecan的表达明显高于非AIS组患者。相比于凹侧,AIS患者顶椎凸侧原代软骨细胞中Sox9及软骨特异性标记物CollagenⅡ及Aggrecan表达明显升高。[结论] Sox9在AIS患者体内及原代软骨细胞中的表达异常是AIS患者体内软骨发育异常及脊柱不平衡生长的重要原因,可能是AIS发生、发展的原因之一。     

退行性腰椎滑脱黄韧带病理组织学和免疫组化的观察

目的:探讨退行性腰椎滑脱症患者黄韧带椎板间部组织学特征和新生成胶原的主要种类.方法:对手术切除的退行性腰椎滑脱椎板间部黄韧带进行常规HE染色和Masson三色改良法胶原染色,同时用免疫组化的方法检测退变黄韧带中Ⅱ型胶原的表达情况,普通光镜观察.结果:退行性腰椎滑脱组黄韧带弹力纤维减少,胶原成分显著增加,结构紊乱;免疫组化示基质染色明显深于对照组,其浅黄色至棕褐色阳性表达产物也见于成纤维细胞、成软骨细胞和软骨细胞的胞浆中,Ⅱ型胶原表达阳性率和表达强度与正常组之间差异均具有显著性(P＜0.01或P＜0.05).结论:退行性腰椎滑脱黄韧带退变增生肥厚,并有软骨化和骨化倾向,新生的胶原以Ⅱ型胶原为主.     

残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体外软骨形成实验研究

目的探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源干细胞(adipose derived stemcells,ADSCs)向软骨分化并形成软骨样组织。方法取外耳再造术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织与皮下脂肪组织分离培养,分别收集第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs,以3∶7比例混合培养作为实验组(A组),单纯残耳软骨细胞和单纯ADSCs作为对照(分别为B组和C组)。取各组细胞1.0×106个离心培养获得细胞球后,体外培养28 d,大体观察各组细胞球取材时的外观变化,测量湿重;阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RT-PCR检测各组标本的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA表达;并行HE、甲苯胺蓝、番红O组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果体外培养28 d后,A、B组标本形成白色半透明圆盘状组织块,表面光滑,弹性可;C组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性。A、B组标本湿重及GAG含量显著高于C组(P<0.05);A、B组间差异无统计学意义(t=1.820 3,P=0.068 7;t=1.861 4,P=0.062 7)。RT-PCR检测示A、B组标本均可见Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA条带清晰表达,C组未见明显表达;A、B组Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA表达均显著高于C组(P<0.05),A、B组间差异无统计学意义(t=1.457 6,P=0.144 9;t=1.519 5,P=0.128 6)。组织学观察示:A组与B组细胞球标本形成了大量软骨陷窝样结构,细胞外基质均有不同程度染色;C组细胞球标本组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,细胞外基质染色阴性。A、B组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达,C组未见明显表达;A、B组灰度值显著低于C组(P<0.01),A、B组间差异无统计学意义(t=1.661 5,P=0.097 0)。结论残耳软骨细胞可在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织。     

瘦素对于体外培养人类软骨细胞增殖的影响

目的 探讨重组人类瘦素对体外培养软骨细胞增殖活性的影响.方法 选用本院膝骨关节炎(OA)患者行关节置换及外伤致膝关节截肢患者术中取出OA软骨块和正常软骨块,种植于25 cm培养瓶中,采用组织贴块法分离培养软骨细胞,及时传代,选用第2代细胞,进行Ⅱ型胶原免疫组化签定后,以不同浓度的重组人类瘦素刺激培养的第2代软骨细胞,以CCK-8检测不同时段的细胞增殖活性,并比较光镜下细胞形态的变化.结果 Ⅱ型胶原免疫组化证明分离出的是软骨细胞,在不同浓度、不同时段和不同人群,重组人类瘦素刺激对于软骨细胞的增殖影响有统计学差异(P＜0.05),光镜下的细胞形态变小,出现丝状伪足.结论 瘦素可抑制体外培养的软骨细胞增殖,可能在OA的发病和进展中起重要作用.