用流式细胞仪分析尿毒症患者血小板膜糖蛋白的变化

应用流式细胞仪和抗血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰb及GPⅡb／Ⅲa．单克隆抗体，测定了尿毒症患者和正常人血小板表面GPⅠb的量以及静息和用ADP活化条件下，血小板膜GPⅡb／Ⅲa的量。结果表明，尿毒症组血小板膜GPⅠb的量与对照组相比，无显著性差异（P＞0．05）；在静息和活化状态下，尿毒症组血小板膜GPⅡb／Ⅲa的量与正常对照组相比，也无显著性差异（P＞0．05），并且尿毒症组血小板以ADP活化后，其GPⅡb／Ⅲa表达的量与血浆肌酐或尿素氮水平无显著相关性（r＝－0．154，P＞0．05；r＝－0．177，P＞0．05）。提示尿毒症患者血小板膜GPⅠb和GPⅡb／Ⅲa的量无明显异常。     

免疫金标记法研究血小板功能缺陷性疾病

本文利用国产抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体分别制备出抗人血小板膜糖蛋白（GPIb、GPⅡb及GPⅢa）的免疫金探针。以此探针检测了9例“刺参诱聚缺陷症”患者及2例血小板无力症患者血小板膜糖蛋白。结果表明“剌参诱聚缺陷症患者”其静息状态下血小板GPIb、GPⅡb正常，GPⅢa低于正常时照组（P＜0．01）。经“剌参”刺激后，GPⅢa仍低于正常（P＜O．01），而经ADP刺激后GPⅢa可恢复正常。血小板无力症患者其静息状态下GPIb正常，GPⅡb、GPⅢa、均低于正常（P＜0.01）。经“刺参”、ADP刺激后GPⅢa、GPⅡb仍低于正常，（P＜O．01）。     

检测体外血小板活化程度时4种血小板表面活化标志蛋白的比较

利用间接免疫放射法测定血小板表面四种活化标志蛋白的分子数,它们为α-颗粒膜蛋白(GMP—140)、溶酶体膜蛋白(GP—53)、凝血酶敏感蛋白(TSP)及血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物。1.以500U/L凝血酶活化的每个血小板表面,4种蛋白的分子数分别为12099±1089,14878±1919,11976±3066及45000±2900;2.在5μmol/L ADP活化时,表达的分子数为相应凝血酶活化时的27.5%、14.9%、4.7%及61%;3.正常固定全血中其分子数仅为9.8%,15.3%,10.4%和45%。结果提示。在检测血小板活化程度时,GMP—140分子数的测定较TSP特异性高,较GP—53分子表达敏感性好,在正常血小板表面只有极少的分子数,为一较理想的血小板活化检测指标。     

胰岛素对正常人血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa表达的影响及机制

目的 探讨胰岛素对正常人血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb／Ⅲa表达的影响及其机制。方法 建立全血血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达的流式细胞术测定方法，观察胰岛素以及一氧化氮合酶抑制剂硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)、鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂亚甲蓝(MB)分别及与胰岛素联合作用下对血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达的影响。结果 (1)胰岛素对正常人静息血小板膜GPⅡb／Ⅲa表达无明显影响；而显著抑制凝血酶、胶原活化的血小板膜GPⅡb／Ⅲa的上调表达，且该效应呈剂量和时间依赖性；(2)LNAME、MB几乎完全阻断胰岛素对血小板膜GPⅡb／Ⅲa表达的抑制效应。结论 胰岛素可通过NOS→NO→GC→GMP通路抑制血小板膜GPⅡb／Ⅲa的表达。     

胰岛素对正常人血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa表达的影响及机制

目的探讨胰岛素对正常人血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa表达的影响及其机制。方法建立全血血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达的流式细胞术测定方法,观察胰岛素以及一氧化氮合酶抑制剂硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)、鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂亚甲蓝(MB)分别及与胰岛素联合作用下对血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达的影响。结果(1)胰岛素对正常人静息血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达无明显影响;而显著抑制凝血酶、胶原活化的血小板膜GPⅡb/Ⅲa的上调表达,且该效应呈剂量和时间依赖性;(2)L-NAME、MB几乎完全阻断胰岛素对血小板膜GPⅡb/Ⅲa表达的抑制效应。结论胰岛素可通过NOS→NO→GC→GMP通路抑制血小板膜GPⅡb/Ⅲa的表达。     

GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板聚集和胞浆游离钙的影响

[目的]探讨血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板聚集和血小板[Ca2+]i的影响.[方法]比浊法测定PAG;采用Fura-3/AM荧光探针标记血小板胞浆钙离子,使用共聚焦显微镜观察单个血小板荧光强度的变化,计算机图像系统分析血小板[Ca2+]i的变化.[结果]凝血酶(0.03 U/mL)为激动剂时,血小板PAG(M)为(78.2±12.4)%.在所取的62.5～1 000μmol/L RGDS内的5种浓度下,RGDS可呈浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的PAG(M).正常人静息血小板[Ca2+]i荧光强度值为376.1±70.5;凝血酶(0.03 U/mL)激动的血小板[Ca2+]i荧光强度值升高为977.9±108.8;GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS(250 μmol/L)对静息血小板的[Ca2+]i荧光强度值无抑制作用;GPⅡ b/Ⅲa受体拮抗剂RGDS(250μmol/L)作用于血小板后,凝血酶(0.03 U/mL)激动的血小板[Ca2+]i荧光强度值升高受到抑制,抑制率为(9.37±7.5)%.[结论]凝血酶(0.03 U/mL)可以引起血小板的聚集和血小板[Ca2+]i的升高.GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS可以抑制凝血酶(0.03 U/mL)引起的血小板聚集和[Ca2+]i的升高.     

老年冠心病患者血小板蛋白激酶C、蛋白激酶C抑制剂及红细胞蛋白激酶C活性变化的研究

目的 研究蛋白激酶C(PKC)在冠心病的发生、发展中的作用。方法 测定87例心绞痛(AP)患者、91例急性心肌梗死(AMI)患者、90名健康对照(HC)者的血小板胞膜、胞浆PKC、胞浆PKC抑制剂(PKCI)活性和红细胞胞膜、胞浆PKC活性。结果 AP组和AMI组血小板胞膜中PKC活性明显高于HC组，其中AP组与HC组比较，增高62．6％(P＜0．01)；AMI组与HC组比较，增高41．2％(P＜0．01)；AP组与AMI组比较，增高14．2％(P＜0．05)。AP组和AMI组血小板胞浆中PKC活性明显低于HC组。其中AP组与HC组比较，下降36．6％(P＜0．01)；AMI组与HC组比较，下降23．9％(P＜0．01)；AP组与AMI组比较，下降16．7％(P＜0．05)。AP组和AMI组血小板胞浆中PKCI活性明显低于HC组。其中AP组较HC组下降52．9％(P＜0．01)，AMI组较HC组下降26．0％(P＜0．01)。AP组及AMI组红细胞胞膜中PKC活性明显高于HC组。其中AP组与HC组比较，增高33．6％(P＜0．01)；AMI组与HC组比较，增高31．8％(P＜0．01)。AP组及AMI组红细胞胞浆中PKC活性明显低于HC组，AP组较HC组降低27．2％(P＜0．01)，AMI组与HC组比较，降低21．9％(P＜0．01)。结论 PKC可能参与冠心病的发病机制。     

几种药物对脑梗死患者血小板活化功能的影响

探讨几种药物对血小板活化功能的影响。方法将44例脑梗死患者随机分成3组A组15例予盐酸丁咯地尔0．2,B组15例予葛根素0．4,C组14例予三七总皂甙0．4,均加入生理盐水250ml静脉滴注,1次·d-1,共用14d。在治疗前后采用流式细胞术(FCM)对患者血小板α-颗粒膜蛋白(CD62P)和凝血酶敏感蛋白(TSP)进行测定。结果B组与C组治疗后与治疗前比较CD62P与TSP均明显降低(P＜0．05),而A组治疗后与治疗前比较CD62P与TSP均无明显变化(P＞0．05)。结论葛根素与三七总皂甙对血小板活化功能有明显抑制作用,而盐酸丁咯地尔则未见影响。     

应用流式细胞术对冠心病患者血小板活化和白细胞粘附功能的研究

目的 :应用流式细胞术 (FCM)测定血小板活化指标和白细胞粘附功能与冠心病 (CHD)的关系。方法 :利用FCM和单克隆抗体测定 2 2例稳定性心绞痛 (SAP组 )、2 5例不稳定性心绞痛 (UAP组 )和 3 5例急性心肌梗死 (AMI组 )患者的外周血血小板糖蛋白CD62P、CD63、凝血酶敏感蛋白 (TSP)和白细胞粘附分子CD1 1b/CD1 8的阳性表达率 ,并与 2 8例正常人作比较。结果 :UAP组和AMI组的CD62P、CD63、TSP和CD1 8的表达率均显著高于SAP组和正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,各组CD1 1b无显著性改变。结论 :血小板活化和白细胞粘附功能在UAP组和AMI组增强 ,参与了CHD尤其是UAP和AMI的发病过程 ;FCM是测定血小板活化和白细胞粘附功能的可靠方法之一     

活化血小板葡萄糖摄取及血小板膜整合素对其的影响

目的 :了解活化血小板葡萄糖摄取过程及血小板膜整合素对其影响 ,探讨整合素与血小板能量代谢的关系 ,旨在研究血小板能量代谢涉及的信号传导 ,并为目前临床应用血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)单抗抗血小板活化提供新的理论依据。方法 :用液态闪烁计数方法检测在血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单抗 10E5及血小板整合素αυβ3 单抗 6 0 9干预与否情况下凝血酶激活后血小板摄取氚标 2 脱氧葡萄糖 ([3 H]2 DG)率。结果 :在生理浓度范围内活化血小板 [3 H]2 DG摄取率较静息时明显升高 ,单抗 10E5可充分阻断活化血小板葡萄糖摄取 ,单抗 6 0 9可部分阻断。结论 :整合素家族单抗可抑制血小板激活后葡萄糖摄取 ,提示其可能参与血小板能量代谢信号传导过程 ,并可能以GPⅡb/Ⅲa为主     

糖尿病并发脑血管疾病时血小板活化标志的研究

目的血小板活化在糖尿病血管并发症的发病机制中起着重要的作用.本文研究哪些指标在实验诊断上更为敏感或更有价值.方法对85例糖尿病患者(其中47例合并脑血管疾病,38例无血管并发症)与36名年龄匹配的健康人进行了研究.血浆血栓烷B2(TXB2)、11-去氢-血栓烷B2(DH-TXB2)与血浆P-选择素用免疫分析法测定.血小板膜糖蛋白(GP)与血小板纤维蛋白原结合能力用流式细胞仪和单克隆抗体测定.血小板膜表面P-选择素数量用免疫放射法(IRMA)测定.结果并发脑血管疾病的糖尿病患者的血浆TXB2和DH-TXB2明显升高(P＜0.01),后者增高的程度更大,与正常值很少重叠.血小板GPⅠb减少(P＜0.05),GPⅡb和GPⅢa无改变,但GPⅡb-Ⅲa复合物增加(P＜0.01).血小板膜P-选择素与血小板纤维蛋白原结合量显著高于正常(P＜0.001).血小板表面P-选择素的数量以及血浆P-选择素水平也有增高(P＜0.01).另一方面,无血管并发症的糖尿病患者上述指标的改变与正常对照比较无统计学差异.结论血浆DH-TXb2、血小板纤维蛋白原结合量与血小板模P-选择素测定比其它指标更能反映出体内血小板的活化,具有更高的诊断敏感性.     

应用Fura-2/AM荧光双波长法研究抑肽酶对血小板活化的保护作用

目的探讨抑肽酶对血小板活化的保护机制.方法用钙荧光指示剂Fura-2/AM负载人洗涤血小板,用荧光双波长分光光度计比值法测定静息血小板胞浆游离钙浓度([Ca2 ]i)及凝血酶、抑肽酶对[Ca2 ]i的影响.结果在生理胞外Ca2 浓度时,正常人血小板[Ca2 ]i静息水平为(151.840±28.719)nmol/L,凝血酶可引起血小板[Ca2 ]i的明显增加(P＜0.01),抑肽酶呈剂量依赖性地抑制由凝血酶引起的[Ca2 ]i的增加(P＜0.01).结论抑肽酶的保护血小板机制与其抑制血小板内[Ca2 ]i动员等信息传递过程有关.     

GPⅡb基因型急性心肌梗死患者介入治疗前后GMP-140、vWF和PAI-1水平

目的：探讨3种血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb HPA-3基因型急性心肌梗死（AMI）患者经皮冠状动脉介入治疗（PCI）前后血浆中血小板α-颗粒膜蛋白（GMP-140）、血管性血友病因子（vWF）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）变化.方法：对102例AMI患者进行GPⅡb HPA-3基因分型,比较各基因型AMI患者的临床特征,并测定PCI术前、术后即刻及术后24 h3个时间点血浆GMP-140、vWF和PAI-1水平.结果：102例AMI患者中,GPⅡb HPA-3 aa基因型34例,ab基因型38例,bb基因型30例,3种基因型AMI患者的临床特征比较无统计学意义;3种基因型AMI患者GMP-140在PCI术后开始增高（P＜0.01）,术后24 h下降,bb基因组在PCI术后即刻、术后24h较aa、ab基因组均增高（P ＜0.01）;vWF在PCI术后即刻、术后24 h（P ＜0.01）持续增高,但3种基因组间差异无统计学意义;PAI-1在术后即刻、术后24h持续升高,bb基因组在术后即刻、术后24h活性明显高于aa、ab基因组（P＜0.01）.结论：GPⅡb HPA-3基因型AMI患者PCI前后血浆GMP-140、vWF和PAI-1水平发生变化,尤其bb基因型在PCI术后存在更明显的血小板活化.     

益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物及GPⅠbα表达的影响

目的 观察益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者凝血酶受体血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其组分GPⅠbα的表达的影响来探讨其配伍规律.方法 68例出血性血小板病患者及32例健康人静脉血在静息状态及体外加益气活血方及其拆方中药孵育后,采用流式细胞术检测血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα的表达.结果 静息状态时,患者GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα的表达明显低于健康人;益气活血方及其部分拆方组能使患者凝血酶受体GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα恢复至正常水平;而单味中药组作用不明显;方中的主药黄芪与当归配伍为用,可促进血小板膜糖蛋白的表达.结论 益气活血全方及其部分拆方组在受体蛋白水平上调节GP Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰ bα的表达,是其治疗出血性血小板病的疗效机制之一.     

普鲁卡因胺抑制凝血酶诱导的人单个血小板游离Ca~(2+)升高

用570型粘附式细胞仪动态观察普鲁卡因胺（Procainamide，Pro）对凝血酶激活的人单个血小板细胞内游离Ca2+的影响。静息状态时对照组和给药组荧光值均较低。当加入0．1u／ml凝血酶时，荧光强度迅速上升，两组达峰值时间均为20s，但给药组最大升高幅度比对照组低21％（P＜0．05）。随后荧光强度迅速下降，两组下降率均为-1u／s，对照组和给药组下降幅度分别为57％和76％（P＜0．05）。上文结果提示，普鲁卡因胺降低凝血酶诱导的血小板游离Ca2+升高，对Ca2+的再摄取没有影响。     

巴曲酶对急性缺血性脑卒中患者血小板功能的影响

目的 观察巴曲酶治疗对急性缺血性脑卒中患者外周血血小板膜糖蛋白和血小板—白细胞凝集性的影响。方法 治疗组28例，予巴曲酶20BU(1BU=0．17NIH凝血酶单位)治疗3d；对照组25例，除未予巴曲酶外，用药同治疗组。采用流式细胞仪测定脑卒中发病后24h内、48h和72h后外周血血小板膜糖蛋白Ⅱb—Ⅲa复合物α亚单位(CD41)、P—选择素(CD62p)和溶酶体膜蛋白53(CD63)的表达及血小板与淋巴、单核和中性粒细胞的凝集性。结果 与对照组相比，治疗组脑卒中患者发病48h后血小板CD62p的表达升高，发病72h后巴曲酶CD41、CD62p和CD63的表达及血小板—白细胞凝集性均无变化。结论 巴曲酶治疗可激活血小板，有必要同时应用抗血小板药物。     

2型糖尿病患者血小板膜糖蛋白表达初步研究

目的：为进一步了解2型糖尿病患者血小板活化情况。方法：采用流式细胞术检测了45例2型糖尿病患者及26例正常对照者血小板表面血小板膜糖蛋白GP Ib(CD42b)、GPⅡb(CD41a)、P-选择素（CD62p）及血小板激活复合物（PAC-1）的表达。结果：糖尿病患者血小板膜糖蛋白P-选择素（P=0.04）及PAC-1(P=0.00)表达的荧光强度较正常对照组明显升高；而GP Ib表达的荧光强度较正常对照组显著下降（P=0.01）；GPⅡb表达则无明显改变（P=0.29）。结论：糖尿病患者血小板活化明显增强，PAC-1的表达可作为GPⅡb/Ⅲa激活更敏感的新型特异性标志。     

多球壳菌素对激活的大鼠肾小球系膜细胞增生的抑制作用

目的 探讨多球壳菌素（ISP-Ⅰ）对体外激活的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）的调控作用。方法 分别采用MTT法及流式细胞术检测IL-1、IL-6对GMC的激活作用及ISP-Ⅰ对激活后GMC增生的抑制作用。结果 MTT法结果显示10U／ml IL-1及1000U／ml IL，6刺激GMC24、48h后，反映细胞增生程度的吸光度（A）值较对照组增高（P〈0．05）；激活的GMC在25～500μg／ml ISP-Ⅰ作用24、48h后的A值较对照组低（P〈0．05）。流式细胞术检测的结果与MTT法一致，即GMC被激活12、24、36h时的细胞增生率高于对照组（P〈0．05）；激活的GMC在100μg／ml ISP-Ⅰ作用下，细胞增生率低于对照组（P〈0．05）。结论 ISP-Ⅰ对激活后的GMC有明显抑制作用。     

凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的　探讨凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞 (Vascularsmoothmusclecells ,VSMCs)的促增殖作用的量效和时效关系。方法　采用 4～ 10代的VSMCs的单细胞悬液用于实验。 0 .1,0 .5 ,1,3,10U/ml凝血酶刺激VSMCs 2 4h或 0 .5U/ml和 1U/ml凝血酶刺激VSMCs 0 ,1,6 ,12 ,2 4,48,72h ,采用MTS法和 β N 乙酰氨基己糖苷酶测定VSMCs细胞增殖率。结果　①不同浓度的凝血酶对VSMCs有明显促增殖作用 (P <0 .0 1) ;但凝血酶浓度为 0 .1～ 10U/ml在 2 4h时对VSMCs的促增殖作用无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;② 0 .5 (U/ml)和 1.0 (U/ml)两种浓度的凝血酶促VSMCs增殖相对于对照组 ,在各时间段均有明显促增殖作用 (P <0 .0 5 )。增殖曲线呈双峰样改变 ,1h和 2 4h峰值说明凝血酶对VSMCs的促增殖作用不仅有迅速而短暂的作用 ,而且有后发迟缓的作用。结论　①凝血酶浓度在 0 .1～ 10U/ml之间促VSMCs增殖无浓度依赖性 ;②凝血酶促VSMCs的增殖在时间上呈双峰样改变。     

山莨菪碱对凝血酶诱导的血小板钙内流的影响

血小板在生理性止血及某些病理过程中起着重要作用。近年研究表明,血小板激活时,发生钙离子动员,即胞内钙离子释放和胞外钙离子内流,血小板内胞浆游离钙浓度升高,血小板发生变形,释放和聚集反应,提示钙离子作为第二信使调节血小板功能。本文以正常人血小板为研究对象,采用钙离子荧光指示剂Quin2-AM,测定血小板胞浆游离钙离子浓度,观察正常人血小板静息胞浆游离钙离子浓度,凝血酶对血小板钙转运的影响以及山莨菪碱对凝血酶诱导的钙内流的作用。结果表明,正常人血小板静息胞浆钙离子浓度为115 31nmol/L(n=16)凝血酶可在30s内迅速引起胞浆钙离子浓度升高,1～3min内达高峰。如以