嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA快速提取方法

目的　建立一种快速简便提取嗜麦芽黄单胞菌 (X anthomonas maltophilia)基因组 DNA的方法。方法　用去污剂 SDS和 CTAB破坏细胞膜结构 ,使胞内核酸释放 ,用酚 /氯仿 /异戊醇去除蛋白质 ,异丙醇沉淀DNA,TE溶解 DNA。结果　提取的 DNA琼脂糖电泳图谱与 Hauben及 Dufresne方法提取的 DNA图谱相同 ,DNA含量为 34 2～ 388μg/ m l,OD2 60 / OD2 80 为 1.88～ 1.90。 DNA能被 Eco R 酶切消化。结论　本方法能快速简便提取 X.maltophilia DNA,提取的 DNA含量较高、纯度较好 ,可用于酶切分析、构建文库及 PCR操作。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的:优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法:用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果:经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚/氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论:一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

百合鳞叶总DNA提取方法的改进

目的建立一种适合RAPD分析的百合鳞叶总DNA提取方法。方法在传统CTAB提取方法上,对其进行改良,进一步优化提取方法。结果用改良CTAB法提取的总DNA的OD260/OD280在1.6-2.0之间,电泳条带清晰,其含量和纯度完全满足RAPD分析的要求。结论该方法提取百合鳞叶总DNA简便实用。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的：优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法：用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果：经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论：一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

用于慢病毒包装的高纯度质粒 DNA 的大量制备和应用

目的：建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法：培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果：本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2．5mg／L菌液,OD260/OD280=1．91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85％以上;可用于慢病毒包装。结论：本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求。     

一种通用的从少量培养液中快速提取细菌染色体DNA的方法

目的　建立一种通用、快速、简便的提取细菌染色体DNA的方法。方法　用丙酮破坏细菌细胞壁膜脂质结构 ,裂解液破除细菌细胞膜 ,释放胞内核酸 ,经酚 /氯仿 /异戊醇去除蛋白质及多糖 ,无水乙醇沉淀DNA ,TE缓冲液溶解DNA。结果　提取染色体DNA的琼脂糖电泳图谱 ,对于G 杆菌与经典的CTAB法提取的DNA图谱相同 ,对于G 球菌其效果要明显好于CTAB法。所得DNA能被HindⅢ酶切消化 ,能用于RAPD扩增。结论　这种提取染色体DNA的新方法 ,对于所收集的 8种不同的细菌都有较好的结果 ,是一种通用的细菌染色体DNA提取方法。     

LAMP技术检测单纯疱疹病毒-2型的初步应用

目的建立一种对单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)进行快速、高效、简便的LAMP检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-2基因组DNA,设计4条扩增HSV-2糖蛋白gG基因的LAMP引物,以灭菌水为阴性对照,进行LAMP,LAMP产物经电泳、酶切鉴定。将HSV-2 DNA作10倍系列稀释后进行LAMP,检测其敏感性。结果HSV-2 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增条带。LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实。LAMP检测HSV-2的敏感性为0.01 ng/μL。结论检测HSV-2的LAMP方法特异、敏感、简便。     

白假丝酵母菌DNA提取方法的研究

目的建立一种提取白假丝酵母菌DNA的有效方法。方法采用蜗牛酶消化破壁形成原生质体,饱和酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳及PCR反应等进行鉴定。结果提取物经琼脂糖凝胶电泳检测到DNA主带,基本无DNA碎带,提取的DNA浓度为(1.18±0.36)μg/μl,纯度好(OD260/OD280>1.7),不用RNase酶处理,无需任何纯化即可用于PCR扩增。结论本研究中提取DNA的方法简便易行,提取物可适用于各种分子生物学研究。     

Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG的应用体会

目的探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒,将环状质性DNA酶切为线性,0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD(A260/A280)比较差异无统计学意义[分别为(1.8±0.6),(1.9±0.4),P0.05],经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA,Chelex-100法简便、省时,值得推广。     

盐析法快速提取口腔拭子DNA

目的建立盐析法快速从口腔拭子中提取基因组DNA的方法。方法首先以细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5 mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984位点进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果单支口腔拭子提取得到的DNA量在0.68～2.56μg之间,D260/D280比值在1.77～1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。结论本实验所建立的盐析法可以快速、简便、经济地从口腔拭子得到高质量的基因组DNA。     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。     

一种制备质粒DNA的改良碱裂解法

目的介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。方法使用替代试剂，建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取，并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量，紫外测量估算产量及纯度。限制性酶切验证其用度。结果琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮，以超螺旋方式为主。A260／280为1．903，含量为320μg／mL，酶切后得到约500bp的目的片段。结论改良碱裂解法操作简单、实用，所得样品纯度高，达到了分子生物学常规实验的要求。     

玄参总DNA提取方法的比较研究

目的探讨药材玄参总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法和CTAB法提取药材玄参总DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳检测。结果采用SDS法提取的总DNA其OD260/OD280=1.83,而采用CTAB法提取的总DNA其OD260/OD280=1.64;DNA电泳检测显示采用SDS法提取的总DNA条带清晰,而采用CTAB法提取的总DNA出现严重的拖尾现象。结论用SDS法提取药材玄参总DNA优于CTAB法。     

金银花药材脱氧核糖核酸(DNA)提取方法的研究

目的:研究金银花药材总脱氧核糖核酸(DNA)的提取方法。方法:对经典的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行了改良,采用改良的CTAB法提取金银花药材的总DNA,通过紫外吸收、琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。结果:用改良的CTAB法提取的总DNA的OD260/OD280比值在1.76-1.85之间,干药材提取率为89.8-325.4μg/g。结论:用改良CTAB法提取的基因组DNA纯度高,符合分子生物学的要求。     

一种快速高效提取全血基因组DNA的实验方法

目的 建立一种快速的从少量全血中高效提取基因组DNA的实验方法 .方法 首先低渗处理红细胞,收集白细胞,然后裂解白细胞释放核蛋白,在去污剂及乙酸钾的作用下使核酸与蛋白分离,最后沉淀、纯化DNA.扩增管家基因(β-globin)观察提取效果.结果 该法收集的DNA纯度(OD360/OD280)为(1.82±0.4);每毫升外用血可得DNA19.0～37.0μg,片段大小10～13kb;β-giobin基因扩增电泳带清晰.结论 该法提取DNA简便、高效和经济,易于各级分子生物学实验室使用.     

两种方法提取的DNA在脆性X综合征基因FMR-I检测中的比较

目的 探索一种更简便、更快速的DNA提取方法用于脆性X综合征的基因检测。方法 用经典的苯酚-氯仿-异戊醇提取的DNA和用饱和盐法提取的DNA用于脆性X综合征的基因检测并进行比较。结果 两种方法提取的DNA在纯度和产量上存在差异，但在脆性X综合征基因检测包括完成PCR和SouthernBlot杂交两种实验时结果均无差异。结论 用饱和盐法提取的DNA可用于脆性X综合征基因的检测，它比传统的苯酚-氯仿-异戊醇提取法更简便、快速和经济，可用于临床上对脆性X综合征的筛查。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法 根据已公布的HBVDNA序列，在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeⅠ）酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序，结果 （1）所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便，快速，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时；灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBVDNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实，（2）应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测，发现YMDD变异者（45%）9例，YMDD野毒株者（55%）11例，表明该方法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株，结论 本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单，敏感，特异，适合于一般实验室应用及大规模的人群调查。     

pUHD10-3-p53质粒的扩增及分离纯化

目的:建立一种确实有效的pUHD10-3-p53质粒提取方法,为科学研究制备高纯度pUHD10-3-p53质粒奠定基础.方法:将克隆有Wt-p53基因的eDNA质粒(pUHD10-3-p53)转染感受态细菌E.coli DH5a菌株.经扩增,用小量碱裂解法提取质粒DNA,再纯化后,用紫外分光光度计测定其含量,并进行酶切电泳鉴定.结果:pUHD10-3-p53质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,可观察到3.15、1.8 kb两条区带.结论:用小量碱裂解法提取pUHD10-3-p53质粒,效率高,质量稳定,得到的质粒DNA的质量与纯度均符合实验要求.     

通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型

目的：利用通用引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒RNA，并经限制性内切酶酶切鉴定病毒型别。方法：用C6／36细胞培养登革病毒，碘化钠法提取病毒RNA，利用通用引物进行RT-PCR，对PCR产物用Mav I限制性内切酶酶切鉴定。结果：应用通用引物RT-PCR方法可检测到含量为0．212ng／L的病毒RNA，扩增的产物及酶切片段与预期的靶序列长度和限制酶谱分析相一致。结论：用登革病毒NS1区通用引物通过RT-PCR并经酶切分型，是诊断登革病毒感染的一种简易快速的方法。     

耐辐射球菌基因组DNA酶切条件的优化

目的研究耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans R1基因组DNA酶切的优化条件,从而获得构建基因文库所需的DNA片段,旨在构建DR菌基因组DNA表达文库,进一步筛选文库中与其有相互作用的蛋白。方法培养耐辐射奇球菌,提取基因组DNA,用Sau3AI酶切DR菌基因组DNA,分别从酶浓度、酶切时间等选择酶切产生的DNA片段集中在0.5-5.0 kb的最佳条件,最后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果Sau3AI酶切DR菌基因组DNA的最佳酶浓度为0.125 u/10μL,最佳作用时间为3 h,此条件下DR菌基因组DNA片段主要集中于0.5-5.0 kb。结论优化了DR菌基因组DNA的酶切条件,为进一步构建DR菌基因组DNA表达文库,筛选与高抗辐射相关基因产物的互作蛋白奠定了基础。