HCV 多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫获得血清内中和抗体评价

目的:纯化的HCV 多中和抗原表位及HCV 包膜蛋白E2 嵌合的HBV S 抗原病毒样颗粒免疫新西兰兔,测定免疫血清内的中和抗体。分析中和抗体对HCVpp 感染Huh7.5 的中和作用。方法:纯化的HCV 多中和抗原表位及包膜蛋白E2 嵌合的HBV S 抗原病毒样颗粒(VLPs-MEpS、VLPs-E2S)10 滋g 皮下接种新西兰兔,间隔2 周共免疫3 次,采集不同时间免疫兔血清,ELISA 方法测定血清内的抗体,PBS 组作为对照;制备1b 型HCVpp,观察血清抗体对HCVpp 感染Huh7.-5 的中和作用,对免疫血清保护性进行初步评价。结果:免疫后血清中产生一定水平的中和抗体,血清中和抗体测定VLPs-MEpS 明显高于VLPs-E2S(P<0.05)。VLPs-MEpS 与VLPs-E2S 组均显著高于对照PBS 组(P<0.01)。对HCVpp 抑制作用,VLPs-MEpS 高于VLPs-E2S 组(P<0.05),最高中和率可达61.49%,二者均高于对照组(P<0.01)。结论:嵌合病毒样颗粒免疫新西兰兔后产生一定水平中和抗体,该中和抗体具有保护作用,为研发中和抗体表位疫苗奠定基础。     

HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫获得血清内中和抗体评价北大核心CSCD

目的:纯化的HCV多中和抗原表位及HCV包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒样颗粒免疫新西兰兔,测定免疫血清内的中和抗体。分析中和抗体对HCVpp感染Huh7.5的中和作用。方法:纯化的HCV多中和抗原表位及包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒样颗粒(VLPs-MEp S、VLPs-E2S)10μg皮下接种新西兰兔,间隔2周共免疫3次,采集不同时间免疫兔血清,ELISA方法测定血清内的抗体,PBS组作为对照;制备1b型HCVpp,观察血清抗体对HCVpp感染Huh7.5的中和作用,对免疫血清保护性进行初步评价。结果:免疫后血清中产生一定水平的中和抗体,血清中和抗体测定VLPs-MEp S明显高于VLPs-E2S(P<0.05)。VLPs-MEp S与VLPs-E2S组均显著高于对照PBS组(P<0.01)。对HCVpp抑制作用,VLPs-MEp S高于VLPs-E2S组(P<0.05),最高中和率可达61.49%,二者均高于对照组(P<0.01)。结论:嵌合病毒样颗粒免疫新西兰兔后产生一定水平中和抗体,该中和抗体具有保护作用,为研发中和抗体表位疫苗奠定基础。     

丙型肝炎病毒河北株E2蛋白胞外核心区的真核表达及应用

目的真核细胞表达丙型肝炎病毒(HCV)河北株E2蛋白胞外核心区(E2c)并利用E2c蛋白检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平。方法以HCV1b型(河北株)基因序列为基础,设计HCV1b E2c基因序列并通过基因拼接的方法合成;将含有组织型纤溶酶原激活物(t PA)信号肽的E2c扩增产物克隆入p CI-neo真核表达载体,获得p CI-tpa-1b E2c载体;将p CI-tpa-1b E2c真核表达载体转染HEK293T细胞,收集细胞上清后进行浓缩及纯化,Western blot法鉴定蛋白特异性;以获得E2c蛋白为抗原,建立基于雪花莲凝集素(GNA)的改良ELISA检测HCV患者血清特异性抗E2c抗体水平。结果成功利用真核表达系统表达获得E2c蛋白,建立了GNA改良ELISA检测HCV患者血清中抗E2蛋白抗体的方法。结论成功在HEK293T细胞表达HCV-1b E2c蛋白并进行了临床应用。     

抗间质上皮转化因子(c-Met)单价抗体的制备及生物学活性检测

目的用抗人间质上皮转化因子(c-Met)阻断型嵌合抗体ch3E1D7表达质粒构建单价抗体慢病毒穿梭质粒,利用慢病毒表达系统实现其在HEK293T细胞中快速表达,并对纯化后抗体的亲和力及中和活性进行检测。方法设计抗c-Met的单价抗体,命名为mono3E1D7,利用基因工程技术构建单价抗体三条链的慢病毒表达载体,磷酸钙法转染HEK293T细胞,表达的单价抗体经蛋白A琼脂糖4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测抗体完整性,ELISA检测单价抗体在体外阻断c-Met与其配体HGF结合的生物学活性。结果感染单价抗体慢病毒的HEK293T细胞上清纯化后,SDS-PAGE分析可见55 ku的重链、25 ku的轻链以及30 ku的杵状结构链(Knob)三条带。且纯化后的单价抗体能与c-Met抗原结合,同时还具有阻断c-Met与HGF结合的中和活性。结论成功获得抗人c-Met阻断型单价抗体。     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.     

血清前S1抗原检测的临床价值

前S1(PreS1)蛋白是乙型肝炎 (乙肝 )病毒 (HBV)的S基因编码的蛋白 ,由 10 8或 119个氨基酸组成 ,主要存在于完整的病毒颗粒 Dane颗粒上 ,具有高度的免疫原性 ,可与肝细胞膜上的HBV前S1抗原受体结合而导致感染。我科对 2 85例血清ELISA检测HBsAg阳性者进行HBV DNA、HBV1、2、3、4、5五项 (HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)及前S1抗原检测 ,以了解其临床价值。我院 2 0 0 1年 8月至 2 0 0 2年 2月门诊和住院患者中血清HBsAg阳性者 2 85例。MR4 10 0酶标仪 ,WELLWash4MK2洗板机 ,PE5 70 0型PCR扩增仪。中国科学院…     

抗人肝细胞生长因子受体单链抗体慢病毒载体的构建和应用

目的构建可表达抗人肝细胞生长因子受体(HGFR)单链抗体(scFv)的慢病毒表达载体,将其感染HEK293细胞,检测该抗体的表达及与抗原结合活性。方法采用反转录PCR(RT-PCR)从分泌小鼠抗人HGFR抗体的杂交瘤细胞株(8E8)中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL进行拼接,得到含有信号肽SP-VH-linker-VL的单链抗体基因(HGFR-scFv),将其插入克隆载体pCR-Blunt中。用内切酶将HGFR-scFv基因从pCR-Blunt上切下,插入慢病毒载体pRRL-CMV中,经相应酶切和测序鉴定,正确构建慢病毒表达载体pRRL HGFR-scFv。磷酸钙法转染HEK293T细胞,48 h后通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,将获得病毒颗粒进一步感染HEK293细胞,RT-PCR和ELISA检测scFv的表达情况。结果抗人HGFRscFv的慢病毒表达载体构建成功,病毒颗粒感染HEK293细胞后,得到了可以稳定表达抗人HGFR-scFv的细胞系;ELISA结果表明,scFv能与人HGFR特异性结合。结论成功克隆了小鼠抗人HGFR抗体的scFv基因,并构建其慢病毒表达系统。     

建立人促甲状腺素受体α亚基HEK 293T细胞稳定表达株

为研究抗甲状腺多肽的特异性与亲和力,本研究建立了人促甲状腺素受体(TSHR)α亚基(hTSHRA)稳定表达株。构建hTSHRA到慢病毒质粒GV218上形成GV218-hTSHRA,挑取GV218-hTSHRA构建物阳性大肠杆菌克隆,提取DNA测序结果与人TSHRA序列比对,100%吻合。结果显示:GV218-hTSHRA转染到HEK 293T后,Western blot显示,HEK 293T细胞提取蛋白出现52kD的hTSHRA目的条带。GV218-hTSHRA、辅助质粒在HEK 293T细胞中包装后,HEK 293T细胞表达绿色荧光蛋白。收取浓缩的包装病毒,qPCR测定滴度达到了2×108 TU/mL。再将包装病毒转染到HEK 293T细胞中,hTSHRA即表达在HEK 293T细胞上,细胞传代后hTSHRA仍然稳定表达。结果表明获得GV218-hTSHRA包装质粒,并建立了hTSHRA-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽与人TSHRα亚基特异性与亲和力提供了必要的实验材料。     

HEK293T细胞表达的单核细胞趋化蛋白1促进巨噬细胞迁移

目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)真核表达载体,转染人胚肾HEK293T细胞,验证其对巨噬细胞的趋化作用。方法小鼠基因组DNA作模板,用PCR法获得MCP-1启动子区基因片段,插入p FLAGCMV1载体。用双酶切法和测序鉴定正确后,将构建好的病毒载体转染HEK293T细胞,用Western blot法检测MCP-1的表达,用Transwell~(TM)实验检测转染后细胞分泌的MCP-1对巨噬细胞的趋化作用。结果重组载体酶切鉴定在相应位置有目的片段,转染单核细胞趋化因子重组载体后的HEK293T细胞有MCP-1表达,转染后HEK293T细胞分泌的MCP-1明显增加巨噬细胞的迁移。结论HEK293T细胞表达的MCP-1明显增强巨噬细胞的迁移。     

多型别HCV-E1复合表位抗原研究

目的 设计多型别HCV-E1表位复合免疫原,通过免疫小鼠,探讨其在丙型肝炎治疗性疫苗与诊断试剂研究中的应用.方法 分析比较HCV-E1包膜糖蛋白B细胞表位序列,选取几个代表性基因型的中和性优势抗原表位,再结合泛DR辅助性T细胞表位(PADRE),构建含有不同HCV型别E1表位抗原基因和通用T辅助细胞表位基因的原核表达质粒.结果 成功构建了含有HCV 1a、1b、2a、3a、4a和6a等基因型E1中和性表位以及通用T辅助细胞表位的质粒pBVIL1/E1s-PADRE,该质粒转化大肠杆菌后获得的工程菌,通过诱导培养可以高效表达重组多型别HCV-E1表位复合抗原,所获得的多型别HCV-E1表位复合免疫原可在BALB/c小鼠体内诱发强烈的体液免疫反应,ELISA检测抗体水平可达到1:12 800.结论 新构建的HCV-E1表位复合免疫原具有很好的免疫原性,为进一步研究HCV疫苗奠定了基础.