冈田酸诱导大鼠脑tau蛋白磷酸化和神经细胞退化

采用免疫组织化学、荧光双标记技术及大鼠额叶皮质定位注射OA的方法 ,观察和研究蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸 (okadaicacid ,OA)对大鼠脑tau蛋白高度磷酸化和神经细胞退化的影响 ,结果表明 :①AT8免疫组织化学染色观察到在 2 0ngOA作用下神经细胞突起远端tau蛋白首先磷酸化 ,出现AT8即PHF tau免疫阳性反应 ,并逐渐向胞体发展 ,形成营养不良的神经细胞突起和神经纤维缠结样神经细胞 ;②细胞计数表明额叶皮质注射 2 0ngOA后 12hAT8免疫阳性神经细胞数显著增多 (P <0 .0 1) ,1d时达峰值 (P <0 .0 1) ,3d后减少 ;注射OA 2 0 ,5 0 ,10 0ng 1d时均大量表达AT8阳性细胞 (P <0 .0 5 ) ,但其各组间无显著差异 ;③免疫荧光双标记结果显示磷酸化tau蛋白在神经元和星形胶质细胞均存在 ,部分tau蛋白高度磷酸化的神经细胞TUNEL染色阳性 ,并伴有核浓缩断裂现象。这提示OA能有效诱导大鼠脑星形胶质细胞和神经元微管相关蛋白tau高度磷酸化 ,从而导致神经细胞DNA损伤 ;后者可能参与了OA诱导的神经细胞退化过程 ,其机制则有待阐明。     

大鼠海马注射溶血磷脂酸诱导tau蛋白高度磷酸化和凋亡研究

目的研究溶血磷脂酸(LPA)在大鼠体内对海马神经细胞tau蛋白磷酸化水平的影响和诱导神经细胞凋亡的细胞毒性作用.方法将72只SD大鼠分为实验组(n=32)、实验对照组(n=32)和对照组(n=8),利用脑立体定位技术在大鼠双侧海马微量注射溶血磷脂酸、溶剂,于注射后12、24、48和72 h各不同时间点采用免疫组化方法测定该区域神经细胞中ser202位点磷酸化tau蛋白(PS202-tau)的表达,TUNEL技术检测细胞凋亡.结果实验组LPA注射后24 h海马CA4区神经细胞中PS202-tau阳性表达到达高峰,阳性表达高于对照组和实验对照组(P＜0.05).LPA注射后48 h TUNEL阳性细胞数达高峰,每个视野中阳性细胞数多于对照组和实验对照组(P＜0.05).结论LPA在动物整体水平可诱导大鼠海马神经细胞tau蛋白高度磷酸化,并导致神经细胞发生凋亡.     

脑缺血对阿尔茨海默病模型大鼠认知功能的影响及其机制探讨

目的 探讨脑缺血对阿尔茨海默病(AD)病程进展的影响及其机制.方法 采用大鼠海马注射凝聚态β-淀粉样蛋白(Aβ)1-40建立AD模型,再于海马内注射ET-1建立脑缺血条件,观察脑缺血后AD样大鼠认知功能以及海马内Aβ沉积、神经元丢失和异常磷酸化tau表达的变化;采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR法检测海马内星形胶质细胞数量和IL-1、TNF-α表达的变化.结果 脑缺血后AD样大鼠的认知功能明显下降,海马内Aβ沉积增加,神经元丢失增加,异常磷酸化tau表达增加.星形胶质细胞的数量以及IL-1和TNF-α的表达显著增加(均P＜0.01).结论 脑缺血加重了AD样大鼠的认知功能障碍和海马病理损伤,显著增加的星形胶质细胞及IL-1和TNF-α的表达参与了这一过程.防治脑缺血和抗炎治疗可能成为减缓AD进展的新途径.     

睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白

背景：睫状神经营养因子具有多种生物活性,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要意义。 目的：观察睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠相应脊髓节段前角星形胶质细胞的特异标记物胶质纤维酸性蛋白表达的影响。 方法：将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组及药物组。除对照组外,对所有大鼠实施双侧坐骨神经切断吻合术,药物组手术区局部注射睫状神经营养因子100 ng/kg,1次/d,生理盐水组局部注射等量生理盐水。术后1,3,7,14,21,28 d取相应脊髓节段,免疫组织化学染色观察胶质纤维酸性蛋白的表达,苏木精-伊红染色、TUNEL染色对脊髓前角神经元进行计数。 结果与结论：大鼠坐骨神经切断吻合后相应脊髓节段星形胶质细胞胞体大,突起分枝多且粗大,神经元数目逐渐减少,凋亡神经元增多,胶质纤维酸性蛋白表达增高。与模型组和生理盐水组比较,药物组神经元存活数目增多,凋亡减少,胶质纤维酸性蛋白表达明显增加(P < 0.05或P < 0.01)。同时,药物组大鼠的运动功能障碍较轻,恢复较快。说明睫状神经营养因子可以通过促进大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白的表达起到神经保护作用。 关键词：胶质纤维酸性蛋白;睫状神经营养因子;星形胶质细胞;神经元凋亡;周围神经损伤     

水通道蛋白4抗体对体外培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用

目的 观察水通道蛋白4(AQP4)抗体对体外培养的大鼠皮层神经细胞的毒性作用,探讨其在视神经脊髓炎发病机制中的作用.方法 选取孕16～19 d Wistar大鼠胚胎皮层神经细胞培养3d,采用随机数字表法分为2组:对照组、AQP4抗体阳性患者血清组(抗体组).对照组以10％的比例加入正常人血清,抗体组加入等量AQP4抗体阳性患者血清培养.2h、4h、6h后使用免疫组织化学荧光染色观察星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞形态及数量的变化.结果 对照组不同时间点3种神经细胞形态和数目无任何变化:抗体组2h后就出现星形胶质细胞肿胀、小胶质细胞体积增大以及神经元轴突断裂等形态学的改变,但3种细胞数量无明显变化:4h后星形胶质细胞和神经元比例分别为(24.73+5.27)％和(35.49+8.43)％,明显少于对照组[(30.34±4.53)％和(48.60±1 0.99)％],差异有统计学意义(p＜0.05);小胶质细胞比例较对照组明显增多[分别为(27.35±13.17)％和(16.44±2.70)％],差异有统计学意义(P＜0.05);6 h后3种细胞数量变化更为明显(P＜0.05).结论 AQP4抗体能导致体外培养的大鼠皮层星形胶质细胞和神经元死亡以及小胶质细胞的活化,推测其在视神经脊髓炎的发病机制中发挥一定作用.     

GFAP和Fos蛋白在戊四氮致痫大鼠前脑中的表达变化

目的 研究大鼠在戊四氮导致癫痫发作时前脑内星形胶质细胞和神经元的形态学反应及其相互关系。方法 应用免疫组织化学单标记法分别显示前脑内GFAP和Fos蛋白表达的时间规律，并用免疫组织化学双重标记显示GFAP和Fos蛋白表达的相互关系。结果 在戊四氮导致大鼠癫痫发作早期，前脑的星形胶质细胞被激活，细胞体积增大，突起粗大，GFAP表达阳性，随着存活时间的变化，星形胶质细胞的反应经历先逐渐升高后降低的过程。被激活的星形胶质细胞和神经元表达Fos蛋白阳性，也呈现逐渐升高又降低的变化；另外，GFAP阳性星形胶质细胞和Fos阳性神经元在前脑主要分布在大脑皮层、海马、杏仁核等部位，二者的分布特征基本一致。结论 星形胶质细胞可能和神经元一起参与了戊四氮所致癫痫发作的变化。     

Alzheimer病患者脑tau、β-tubulin的表达

目的 观察Alzheimer病（AD）患者脑tau、β-tubulin的表达、分布与神经元骨架改变的关系。方法 采用免疫组织化学方法观察tau、β-tubulin,在8例AD、5例非痴呆老人（ND）脑海马、嗅球、脑室周围皮质等部位的表达并进行半定量分析。结果 （1）AD组tau蛋白与ND组相比表达明显增加（P＜0．001）,主要在额叶、颞叶、海马、脑室周及嗅球的表达增高（P＜0．05）;顶叶、枕叶无明显差异。大脑新皮层、海马神经元树突、胞膜均有表达,细胞核膜部分着色,部分神经元呈典型NET样结构;星形胶质细胞也有表达。此外,神经毡细丝、老年斑亦有广泛表达。ND组tau散在表达,无NFT样神经元。（2）AD组的β-tubulin明显减少（P＜0．001）,额叶、颞叶、顶叶、海马及脑室周表达明显下降（P＜0．05）;而枕叶与嗅球无差异。β-tubulin在ND组,主要是海马及皮质神经元树突上广泛表达,白质区轴索结构也有阳性表达。结论 AD患者脑内tau表达增高且存在区域分布差异;而tau的过度产生与β-tubulin的表达减少和晚期AD脑内广泛的神经元丢失、结构破坏相一致,提示AD脑内神经原纤维缠结形成与二者改变的机制值得进一步探讨。     

褪黑素对Alzheimer病模型大鼠认知功能和海马tau蛋白过度磷酸化的影响

目的 研究褪黑素(MT)对Alzheimer病(AD)模型大鼠认知功能和海马tau蛋白过度磷酸化的影响.方法 给大鼠海马内注射凝聚态β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35制作AD模型;MT组大鼠从制模前7 d至制模后19 d每日腹腔注射MT,AD组大鼠制模后腹腔注射生理盐水;用Morris水迷宫试验检测大鼠的认知功能,银染法观察海马神经元形态,免疫组化法观察过度磷酸化tau蛋白的表达,并与正常对照组比较.结果 MT组大鼠Morris水迷宫试验结果明显好于AD组(均P＜0.001);海马CA1区磷酸化tau蛋白阳性细胞数(60.0±2.3)明显少于AD组(98.4±3.0)(P＜0.001),与正常对照组比较差异无统计学意义;海马CA1区神经元纤维形态较AD组规则.结论 MT可明显改善AD大鼠的认知功能,并且抑制海马tau蛋白的过度磷酸化.     

Aβ25-35注射诱导大鼠海马神经元tau蛋白异常磷酸化

目的　观察大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ2 5 3 5后 ,神经元ser199/ser2 0 2、ser396、thr2 31等位点tau蛋白磷酸化的水平以及糖原合成激酶 3β(GSK 3β)的活性变化 ,探讨Aβ2 5 3 5与tau蛋白异常磷酸化的关系及机制。方法　应用脑立体定向技术给成年大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ2 5 3 55nmol,术后 14d ,采用镀银染色方法观察海马组织神经元病理改变 ,免疫组织化学染色方法和免疫蛋白印迹技术观察大鼠海马tau [pS3 96]、tau [pSpS199/ 2 0 2 ]、tau [pT2 3 1]的表达水平 ,免疫蛋白印迹技术检测海马GSK 3β和磷酸化GSK 3β的水平变化。 结果　凝聚态Aβ2 5 3 5组神经元纤维走行紊乱、增粗、肿胀 ,密集成宽带状 ,轴突深染。海马神经元tau [pS3 96]、tau [pSpS199/ 2 0 2 ]、tau [pT2 3 1]的阳性表达数 (分别为 38 2± 5 9,10 7 6± 8 4 ,78 4± 3 7)明显高于正常组和生理盐水组 (P <0 0 1) ,GSK 3β和磷酸化GSK 3β的水平亦明显高于正常组和生理盐水组。 结论　海马背侧注射Aβ2 5 3 5可通过激活GSK 3β诱导tau蛋白发生异常磷酸化。     

再程序化星形胶质细胞的制备及体外定向分化为神经元的研究

目的探讨再程序化星形胶质细胞制备并在体外诱导其分化为神经元。方法在体外培养大鼠脑皮质来源星形胶质细胞(astrocyte),随后将提纯、鉴定过的第三代星形胶质细胞接种于12孔培养皿中,并分为A、B、C 3组。其中A组为带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的星形胶质细胞,制备再程序化星形胶质细胞;B组为带有GFP基因的空载体病毒转染的星形胶质细胞;C组为未进行慢病毒介导基因转染的星形胶质细胞;转基因1周后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15 d,光镜下观察各组细胞形态变化以及定向神经元分化的差异。结果 A组星形胶质细胞转基因后再诱导15 d,很大部分细胞形态呈神经元样改变,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出且突起较长,表达神经元核蛋白(Neu N)、神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的比例大大提高,相比B组及C组,差异有统计学意义(均P0.05);而B组与C组神经元分化比例的差异无统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导Ngn2基因体外转染星形胶质细胞可制备出再程序化星形胶质细胞,诱导后具有更强的向神经元定向分化能力。