动力性三维培养大尺寸组织工程骨的方法学研究

目的:大段的骨缺损需要在体外构建大尺寸的组织工程骨,需要解决如何保证支架材料内部的种子细胞充分的物质交换及保持种子细胞正常生理功能等问题。对组织工程骨体外构建技术进行综述,寻求适合构建大尺寸组织工程骨的方法。资料来源:检索时间为1991-01/2004-09。检索词为组织工程、生物反应器、细胞培养、支架材料等。检索手段包括电子检索和手工检索等。检索范围:Medline、中国期刊网CNKI数字图书馆(中国期刊全文数据库)、中文期刊数据库(VIP)及sciencedirect数字图书馆中期刊35种。选择关于组织工程骨体外构建的120篇相关文献进行分析、总结。资料选择:对资料进行初审,选取包括组织工程骨的随机对照临床试验(RCT)研究相关文献,筛除明显不随机临床试验的研究文献。数据提炼:排除重复的同一研究和Meta分析研究,符合本研究标准21篇。资料综合:对各种组织工程骨的体外构建的技术方法进行比较分析,并了解其在实验及临床应用中的效果。现有的各种体外构建组织工程骨的方法中,动力性三维培养在提供有利于种子细胞生长的微环境,优化种子细胞在支架材料内部的分布等方面有较大的优势,但各种利用动力性三维培养的实验中,其构建的组织工程骨的尺寸都还比较小,无法满足临床大尺寸骨缺损修复对组织工程骨的要求。结     

生物反应器在组织工程学中的应用及其前景

用于组织工程的生物反应器主要有以下类型：搅拌式生物反应器一般应用于微载体培养细胞或组织构建，但对细胞的剪应力大。灌注反应器克服了机械混合产生的剪应力，可以对细胞的周围环境进行精确的监测和控制。旋转生物反应器是一种水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统，几乎没有破坏性的剪切力，细胞表型表达更充分。生物反应器与微载体相结合，可使细胞培养的数量提高数十倍，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求。生物反应器提供的动态培养可使支架内的氧及营养传质更充分，代谢产物更容易排出，细胞表型更充分地表达，种子细胞可达到远超过被动扩散的深度。生物反应器还能提供很多培养组织所必需的物理信号。     

脉冲电磁场在组织工程骨培养中的研究与进展

骨组织工程是利用组织工程学的原理进行骨缺损的修复与重建，培养过程中模拟细胞在体内生长的微环境是组织工程发展的方向。电学环境是骨组织生长的重要微环境之一，能促进细胞增殖分化，增加细胞外基质的合成分泌。促进骨的形成与成熟。综述脉冲电磁场刺激对成骨系细胞的影响及在组织工程骨培养过程中的应用，分析其作用机制，并对进一步的研究提出探讨。     

生物反应器在组织工程学中的应用及其前景

用于组织工程的生物反应器主要有以下类型:搅拌式生物反应器一般应用于微载体培养细胞或组织构建,但对细胞的剪应力大。灌注反应器克服了机械混合产生的剪应力,可以对细胞的周围环境进行精确的监测和控制。旋转生物反应器是一种水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统,几乎没有破坏性的剪切力,细胞表型表达更充分。生物反应器与微载体相结合,可使细胞培养的数量提高数十倍,可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求。生物反应器提供的动态培养可使支架内的氧及营养传质更充分,代谢产物更容易排出,细胞表型更充分地表达,种子细胞可达到远超过被动扩散的深度。生物反应器还能提供很多培养组织所必需的物理信号。     

三维培养的人成纤维细胞增殖特性在皮肤组织工程研究中的意义

目的探讨三维培养对人皮肤成纤维细胞增殖的影响. 方法培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原.对人皮肤成纤维细胞进行三维培养,检测细胞的增殖特性. 结果三维培养的人皮肤成纤维细胞生长曲线显示细胞增殖缓慢,流式细胞仪检测 7,14 d G0/G1期细胞分别为 (79± 3)% ,(87± 2)%.未见明显细胞凋亡峰. 结论三维培养对人皮肤成纤维细胞增殖有抑制作用.     

生物反应器在组织工程中的应用进展

种子细胞是组织工程学的基本要素之一,种子细胞体外大规模扩增培养是组织工程学的一个重要方面.生物反应器体外大规模扩增动物细胞已成为当前最常用、有效的方法，并且越来越多地在组织工程中得到应用。以此为参考，在新型生物反应器中大规模扩增组织工程种子细胞或体外构建工程化组织，已成为一种全新的研究和治疗思路。     

脉冲电磁场在组织工程骨培养中的研究与进展

骨组织工程是利用组织工程学的原理进行骨缺损的修复与重建,培养过程中模拟细胞在体内生长的微环境是组织工程发展的方向。电学环境是骨组织生长的重要微环境之一,能促进细胞增殖分化,增加细胞外基质的合成分泌,促进骨的形成与成熟。综述脉冲电磁场刺激对成骨系细胞的影响及在组织工程骨培养过程中的应用,分析其作用机制,并对进一步的研究提出探讨。     

可注射性组织工程骨的研究

目的已经有实验证明可用组织工程方法构建可注射性软骨,试图应用组织工程技术探索可注射性组织工程骨的可行性。方法从兔髂骨骨髓细胞中获取骨髓基质成骨细胞,将骨须基质成骨细胞与2.0%藻酸钠溶液混合形成骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物,使细胞的终浓度为5×106/ml。将骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物注射于裸鼠背部皮下,用氯化钙固化为凝胶体。结果注射后4,8周注射物在裸鼠背部皮下形成硬结节,X线片均显示有明显成骨现象。组织学分析显示标本有大量新骨形成,并具有髓腔样结构。结论应用藻酸钠复合骨髓基质成骨细胞可通过注射方式在动物体内形成骨组织。     

生物反应器在组织工程中的应用进展

种子细胞是组织工程学的基本要素之一,种子细胞体外大规模扩增培养是组织工程学的一个重要方面。生物反应器中体外大规模扩增动物细胞已成为当前最常用、有效的方法,并且越来越多地在组织工程中得到应用。以此为参考,在新型生物反应器中大规模扩增组织工程种子细胞或体外构建工程化组织,已成为一种全新的研究和治疗思路。     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

背景：L-聚乳酸可以用于制备骨组织工程支架材料，但存在某些缺陷，能否复合聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原来改善材料性能，从而找到新的组织工程化骨体外构建方法?目的：应用组织工程学技术，体外初步构建有活性的新型组织工程化人工骨。设计：体外构建细胞-材料复合体，自身对照前瞻性研究。地点和对象：本研究在解放军第三军医大学西南医院骨科和兰州铁道医学院复合材料研究所完成，对象为5例重庆市健康志愿者的髂骨骨髓。干预：培养、诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞表型分化，制备性能优越的新型支架材料，再按一定的方法体外构建细胞-材料复合体。主要观察指标：细胞碱性磷酸酶染色的阳性率、扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构。结果：由L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备出新型的骨组织工程复合支架材料，孔径300～450μm，孔晾率90．1％；细胞接种前碱性磷酸酶阳性率为(55&;#177;8)％，接种后细胞可在材料内良好贴附生长，碱性磷酸酶阳性率为(52&;#177;6)％，两者差异无显著性。结论：经成骨诱导的间充质干细胞，可以与由L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备的支架材料复合，在体外构建出组织工程化人工骨。     

组织工程方法构建同种异体工程化骨修复缺损

目的探讨利用组织工程方法构建同种异体骨的可能性.方法从新生大耳白兔干骺端骨组织中经消化分离获得成骨细胞,播种在片状聚乙醇酸无纺网支架材料上,埋入兔体内,经6、8、12周后取材作大体及HE染色组织学观察.结果大体观察见形成了预定的片状骨.组织学观察术后6周可见有大量软骨及部分骨基质新骨形成.8周时软骨内骨化进一步增强.12周时可见大片新骨形成区,未见明显的淋巴细胞浸润.结论兔成骨细胞与聚乙醇酸无纺网复合可在同种异体体内形成预定形态骨.     

微载体培养技术在骨与软骨组织工程研究中的应用

背景：骨与软骨组织工程学中增殖种子细胞和保持细胞特定表型是其难点,微载体生物反应器培养系统提供了很好的条件来解决这个问题。目的：分析近年来国内外骨、软骨细胞微载体培养的研究进展,为骨与软骨细胞微载体培养技术和组织工程研究提供理论基础。方法：由第一作者在2010-11进行检索。检索数据库：PubMed数据库（网址http：//www.ncbi.nlm.gov/PubMed）;万方数据库（网址http：//www.wanfangdata.com.cn）,资料的检索时间范围为1967/2011。英文检索词为＂microcarrier,cartilage,tissue engineering＂,中文检索词为＂微载体,软骨,组织工程学＂。排除与本文无关及陈旧、重复的文章,共保存32篇文献做进一步分析。结果与结论：在微载体培养系统中,可较好的调控骨与软骨细胞培养条件,能在短时间内大量的增殖,并能保持其细胞的表型,甚至出现表型增强现象,在骨、软骨组织工程学研究和临床应用中有着巨大潜力。     

组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望

随着组织工程技术的快速发展,组织工程骨软骨复合组织构建修复骨软骨缺损成为研究热点.骨软骨复合组织的构建仍存在很多难题,还需日臻完善.文章从支架材料设计的种类,包括单层和一体化双层支架;种子细胞的来源和类型,包括自体或异体来源软骨及骨细胞、骨髓基质干细胞和胚胎干细胞;生物反应器技术的应用等方面综述了目前骨软骨缺损修复的研究进展,指出组织工程骨软骨修复骨软骨缺损存在的主要问题,并对日后该方面研究的发展方向提出展望.     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

背景L-聚乳酸可以用于制备骨组织工程支架材料 ,但存在某些缺陷 ,能否复合聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原来改善材料性能,从而找到新的组织工程化骨体外构建方法?目的应用组织工程学技术,体外初步构建有活性的新型组织工程化人工骨.设计 体外构建细胞-材料复合体,自身对照前瞻性研究.地点和对象本研究在解放军第三军医大学西南医院骨科和兰州铁道医学院复合材料研究所完成,对象为 5例重庆市健康志愿者的髂骨骨髓.干预培养、诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞表型分化,制备性能优越的新型支架材料,再按一定的方法体外构建细胞-材料复合体.主要观察指标细胞碱性磷酸酶染色的阳性率、扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构.结果由 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备出新型的骨组织工程复合支架材料,孔径 300～ 450 μ m,孔隙率 90.1%;细胞接种前碱性磷酸酶阳性率为(55± 8)%,接种后细胞可在材料内良好贴附生长,碱性磷酸酶阳性率为(52± 6)%,两者差异无显著性.结论经成骨诱导的间充质干细胞,可以与由 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备的支架材料复合,在体外构建出组织工程化人工骨.     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的：以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法：实验于2002—12／2003—08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。分别于培养的第2，4，6，8，10，12，14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性，并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色，观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果：微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速，约10～11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值，并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增，可以满足骨组织工程量和质的需要。     

皮肤组织工程中人表皮干细胞的体外培养及分化特性研究

目的探索人表皮干细胞( keratinocyte stem cell, KSC)的筛选方法、体外培养条件及生长分化特性. 方法由包皮消化获得表皮细胞,以低密度单克隆筛选法挑取 KSC克隆,并以挑取克隆传代及子代细胞混合传代两种不同的方法持续传代培养,采用 3种不同的滋养细胞.计算每代 KSC子代细胞的克隆形成率( colony forming efficiency,CFE)以及整合素β 1及外皮蛋白的表达情况. 结果将 KSC克隆的子代细胞混合消化传代培养, CFE会逐渐下降,从最初的 95%以上降至第 6代时的 25%左右.每代均可见 3种处于不同分化状态的克隆混合生长,即干细胞克隆(绝大部分细胞未分化,整合素β 1阳性、外皮蛋白阴性)、短暂增殖克隆(部分细胞进入终末分化)、终末分化克隆(所有细胞均发生终末分化,外皮蛋白阳性、整合素β1阴性).以挑取克隆传代法传代培养,其 CFE仍能保持在 95%以上并能持续传代. 结论以低密度单克隆筛选法可成功地筛选出 KSC克隆并能持续传代培养,多种成纤维细胞可作为培养 KSC的滋养细胞. KSC在体外会分裂增殖并逐渐分化,但干细胞的数量比例可以保持在较高水平.     

骨形成蛋白在牙组织工程中的应用

目的生长因子是能够诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等生物效应的蛋白类物质，对细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有促进作用，分析骨形成蛋白在牙及颌面部组织工程中的应用情况。方法应用计算机检索PUBMED 2000-01／2005-01期间的相关文章，检索词为“bone morphogenetic protein”，并限定文章语言种类为英文。同时计算机检索万方数据库20010—01／2005-01期间的相关文章，检索词为“骨形成蛋白”，并限定文章语言种类为中文。对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与骨形成蛋白的研究相关。排除标准：重复研究或Meta分析类文章。结果共收集到161篇相关文献，37篇文献符合纳入标准，排除的124篇文献中是由于内容陈旧或重复。形态发生素在上皮细胞与间充质细胞相互作用时被分泌在细胞外基质中调控发育过程，在组织发生、形成、发育和细胞分化过程中有充分和反复地表达，而骨形成蛋白在成人牙组织再生中具有重要意义。结论尽管目前在牙形成和再生的分子机制的研究上取得了一些进展，但是在牙及颌面部组织工程中应用，还处于早期阶段。而且网络协同作用是生长因子的生物学功能的特点，以此为基础深入研究骨形成蛋白与其他生长因子在组织器官发生、发育及形成过程中的协同作用，是口腔颌面部组织工程领域的一个重要方向。     

组织工程动脉血管平滑肌种子细胞的构建

目的：为组织工程动脉提供种子细胞。从而构建出组织工程化动脉。方法：实验于2004—03／05在首都医科大学宣武医院外科实验室完成。采用组织贴块法培养成年狗主动脉平滑肌细胞，并进行细胞传代、鉴定及形态学观察。结果：通过严格取材即可获得高纯度培养的平滑肌细胞。其形态学特征明显，但随培养代次的增加，其增殖能力及形态出现改变。结论：成年狗主动脉平滑肌细胞可作为动脉组织工程的种子细胞，其增殖能力有待于进一步加强。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的：比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。 方法：实验于2003—12／2004—10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心，采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，分别于培养的第2，4，6，8，10．12，14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。比较两种方法细胞增殖速度（收获细胞数除以接种细胞数，为细胞扩增倍数，以之除以培养天数为增殖速度）。 结果：①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较：培养微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速。10—11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的15—20倍，微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3—5倍，两者差异有显著性（P〈0．01）。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较：两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性（P〉0．05）。 结论：应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导，更快地扩增，利于满足骨组织工程量和质的需要。     

软骨组织工程种子细胞来源的最新研究进展

耳、鼻、喉和气管主要由软骨构成,软骨组织工程技术的进展为这些器官的修复开辟了新的途径。软骨细胞是软骨组织工程修复重建的原动力。在体外培养过程中,随着传代次数的增多,软骨细胞容易失去表型,丧失形成软骨的能力。组织工程软骨形成的重要条件之一是必须获得大量的有功能和活力的种子细胞,因此寻求广泛的种子细胞来源是软骨组织工程修复首先需要解决的关键问题。理想的软骨种子细胞必须具备取材方便、体外有较强的繁殖和定向分化能力等优点。