转染IκBα显性失活突变体对膀胱癌细胞系IL-6和IL-8表达的影响

转染绿色荧光蛋白突变体融合的p6 5质粒和显性失活IκBα质粒入膀胱癌细胞T2 4 ,荧光显微镜和Western印迹检测质粒在细胞中表达情况 ,RT PCR检测IL 6和IL 8的mRNA表达变化。结果表明 :转染 2 4h后 ,两质粒在细胞中稳定表达 ,4 8h后表达持续于高水平 ,转染GFP p6 5质粒 2 4h后IL 6、IL 8的mRNA表达明显增加 ,4 8h后继续高水平表达。转染突变体IκBα质粒 2 4h后 ,IL 6、IL 8的mRNA的表达明显减弱 ,4 8h后IL 6看不到明显的表达 ,IL 8的mRNA的表达进一步减少 ;半定量值比较提示GFP p6 5质粒处理组与未处理组之间、显性失活IκBα质粒转染与不处理组之间、GFP p6 5质粒处理组与显性失活IκBα质粒处理组之间差异均有显著性。这些结果提示转录因子NF κB对膀胱癌中IL 6、IL 8表达水平起调控作用     

显性负性ⅠκBα对乳腺癌细胞株核因子κB通路和运动迁移的影响

目的： 探讨在高转移人乳腺癌细胞中，核因子κB活性对肿瘤生长及运动迁移能力的影响。方法: 转染显性负性突变的ⅠκBα重组质粒入高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435，筛选并鉴定稳定转染的细胞株；凝胶迁移实验观察核因子κB活性，细胞生长曲线、平板集落形成试验及Millicell-PCF培养小室观察质粒转染对细胞生长和趋化运动的影响。结果: 乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞中存在高NF-κB组成型激活，稳定转染显性负性的ⅠκBα质粒后，细胞NF-κB活性下调，在不明显影响细胞生长、克隆形成的情况下，抑制高转移乳腺癌细胞株的运动能力。结论: 在体外，抑制NF-κB通路，可明显抑制高转移乳腺癌细胞株的运动迁移能力。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在前列腺癌细胞株PC-3M中对核因子kappa B活化的影响

目的：研究TRAIL诱导激素非依赖前列腺癌细胞株PC-3M过程中核因子kappa B（NF-κB）的活化和失活现象。方法： 当不同浓度的TRAIL和LPS作用于细胞后，我们通过细胞免疫组化染色和凝胶电泳迁移试验（EMSA）来检测NF-κB核转位的情况。并通过RT-PCR的方法粗略评定二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对抑制蛋白IκB的影响。结果： EMSA和免疫组化分析显示PC-3M细胞中NF-κB的核转位可被TRAIL或LPS明显地激活。以PDTC预处理可以上调抑制蛋白IκB的表达，阻断NF-κB的核转位。结论： TRAIL的作用于激素非依赖前列腺癌细胞时主要的负作用在于其可以显著地刺激NF-κB的活化。另一方面，在PC-3M细胞凋亡过程中NF-κB的核转位可以被PDTC有力地抑制，同时IκB的表达升高和降解减少（PDTC引起的）是抑制NF-κB活化的潜在因素，为我们提出了增强TRAIL疗效的可能性方案。     

转染IкBα显性失活突变体对膀胱癌细胞系IL—6和IL—8表达的影响

转染绿色荧光蛋白突变体融合的p65质粒和显性失活IкBα质粒入膀胱癌细胞T24，荧光显微镜和Western印迹检测质粒在细胞中表达情况，RT-PCR检测IL-6和IL-8的mRNA表达变化，结果表明：转染24h后，两质粒在细胞中稳定表达，48h后表达持续于高水平，转染GFP-p65质粒24h后IL-6，IL-8的mRNA表达明显增加，48h后继续高水平表达，转染突变体IкBα质粒24h后，IL-6，IL-8的mRNA的表达明显减弱，48h后IL-6看不到明显的表达，IL-8的mRNA的表达进一步减少；半定量值比较提示GFP-p65质粒处理组与未处理组之间，显性失活IкBα质粒转染与不处理组之间，GFP-p65质粒处理组与显性失活IкBα质粒处理组之间差异均有显著性，这些结果提示转录因子NF-кB对膀胱癌中IL-6、IL-8表达水平起调控作用。     

蛋白激酶NUAK1的定位及其与NF-κB信号通路关系的探讨

目的:确定蛋白激酶NUAK1的定位,检测其是否参与NF-κB信号通路。方法:构建质粒NUAK1-pEGFP顺转于293细胞,然后用DAPY染核,荧光显微镜下观察NUAK1的定位。构建质粒NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NU-AK1(D178N)-pcDNA3.1,以空载pcDNA3.1做对照,分别过表达于带稳转有NF-κB荧光酶素报告基因质粒的293细胞株中,检测在有或没有TNF-α刺激下的NF-κB荧光酶素报告基因的活性,为进一步确认,对NUAK1-pcDNA3.1设了个浓度梯度进行检测。结果:293细胞中,NUAK1定位于细胞核。在TNF-α的刺激下,以空载和显性失活突变体为对照,NU-AK1显著抑制NF-κB的活性,且与其表达量成正相关。结论:由于NUAK1定位于细胞核中,且显著抑制TNFα刺激下NF-κB的活性,所以NUAK1可能参与NF-κB的转录调控。     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

HSP72过度表达对脂多糖刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响

目的研究过度表达的热休克蛋白72(heat shock protein,HSP72)对脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响.方法构建pCD-hsp72重组质粒,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选稳定转染hsp72基因的细胞,Western印迹检测转染细胞HSP72的表达水平及LPS刺激后RAW264.7细胞内HSP72的表达水平、LPS刺激后转染细胞中IκBα的含量和胞核中NF-κB的含量的变化.结果构建pCD-hsp72重组质粒并转入巨噬细胞,获得稳定转染hsp72基因的细胞株,LPS刺激细胞内HSP72表达增加;HSP72可通过减少LPS刺激的巨噬细胞中IκBα的降解而抑制NF-κB活性.结论HSP72能抑制LPS激活的巨噬细胞中NF-κB的活化.     

超声靶向微泡破坏联合核因子κB结合基序促进SDF-1α质粒转染血管内皮细胞

目的 应用超声靶向微泡破坏技术（UTMD）和核因子κB（NF-κB）结合基序分别促进人基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）质粒进入细胞质和细胞核,提高对血管内皮细胞的转染效率.方法 构建含NF-κB结合基序的人SDF-1α质粒（phSDF-1α-NF-κB）和不含NF-κB结合基序的人SDF-1α质粒（phSDF-1α）,用核酸染料Cy3标记后在优化的UTMD条件下分别转染人脐静脉血管内皮细胞.流式细胞仪检测质粒入胞效率;荧光显微镜观察质粒入核情况;RT-PCR、Western印迹和ELISA分别从基因水平和蛋白水平检测SDF-1α质粒的表达.比较两种质粒的入胞率、入核率以及表达率以评价UTMD和NF-κB结合基序对转染的作用.结果 UTMD能显著提高质粒的入胞效率（81％±7％）,同时保持较高细胞存活率（86％±6％）.含NF-κB结合基序组的质粒入核效率和蛋白表达效率均较不含NF-κB结合基序组显著提高[65％±12％比10％±3％,（63±10）比（15±5）μg/g蛋白,均P＜0.01].结论 UTMD联合NF-1κB结合基序转染系统通过提高质粒的人胞和入核效率能显著提高SDF-1α质粒对血管内皮细胞的转染效率.     

大肠癌组织中转移相关因子表达与NF-κB活性的相关性

目的 探讨大肠癌组织中转移相关因子与核因子κB（NF-κB）的表达特点及相互关系。方法 用Western blot法检测大肠癌及正常组织中NF-κB、环氧合酶-2（COX-2）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）以及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达。结果 （1） 大肠癌组织中,NF-κB活性升高（P<0.05）;（2） 在NF-κB表达升高的肿瘤组织中,COX-2、ICAM-1和VCAM-1表达升高的比例约占75%。（3） 大肠癌组织中MMP-9与其抑制蛋白SM22α的表达呈负相关。结论 大肠癌组织中转移相关因子的表达与NF-κB活性呈正相关,与肿瘤的进展和转移密切相关。     

胃癌组织中NF-κB和COX-2的表达及临床意义

目的：探讨核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达与胃癌发生发展的关系,为开展以NF-κB和COX-2为靶标的胃癌防治提供理论依据。方法：采用免疫组织化学染色法（SP法）检测对照组10例正常胃黏膜及实验组50例胃癌组织中NF-κB和COX-2的表达情况,分析它们在不同组织中的表达、相互关系及与胃癌的关系。结果：实验组NF-κB和COX-2的表达阳性率明显高于对照组（P<0.001）;NF-κB表达与胃癌淋巴结转移、分化程度有关（P<0.05）,COX-2 表达与淋巴结转移有关（P<0.05）;胃癌组织中NF-κB与COX-2的表达呈正相关关系,相关系数r=0.5238 （P<0.01）。结论：NF-κB和COX-2参与胃癌的形成,且与胃癌的侵袭、转移及预后有一定的关系。NF-κB与COX-2表达呈正相关,提示它们在胃癌的发生发展中起协同作用。     

编码N端截短的IκBα突变体重组腺病毒的构建与鉴定

目的：通过去除N端丝氨酸32/36磷酸化位点，获得人胎盘组织IκBα突变体（IκBαM）基因，构建其复制缺陷型重组腺病毒（AdIκBαM），并进行体外表达和活性检测。方法:PCR定点克隆IκBαM基因（203-1 003 bp），亚克隆至pShuttle和pGEM-T，进行PCR、双酶切、DNA测序和同源性分析。将重组质粒pShuttle-IκBαM中含CMV启动子、IκBαM cDNA和PolyA信号的表达单元定向插入Ad5腺病毒载体，构建成重组腺病毒AdIκBαM，再经脂质体介导共转染293细胞进行包装。Western blotting检测AdIκBαM在293细胞中蛋白表达情况，电泳迁移率实验观察AdIκBαM抑制佛波酯诱导的ECV304细胞核因子κB（NF-κB）激活的作用。结果:成功克隆长801 bp的新型IκBαM基因，与GenBank中登陆的IκBα基因（接受号M69043）相应核苷酸序列一致。所制备的AdIκBαM滴度为4.0×1012 pfu/L。AdIκBαM介导IκBαM基因在293细胞中表达，并以剂量依赖性方式显著抑制佛波酯诱导的ECV304细胞NF-κB活化 。结论：AdIκBαM有效介导IκBαM基因表达并特异性抑制NF-κB活性，有望应用于哮喘的基因治疗。     

羟基喜树碱通过激活NF-κB诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡

 目的: 探讨NF-κB信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中所起的作用。方法: 突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染Bcap-37细胞，并用G418进行阳性克隆选择；采用MTT法测定细胞的增殖活力，琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡，流式细胞仪进行细胞周期分析，Western blotting法和DIG-EMSA研究细胞凋亡途径。结果: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制作用，琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状条带；羟基喜树碱可通过降解IκBα 蛋白进而激活NF-κB，并使NF-κB发生核移位；羟基喜树碱没有激活突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染细胞的NF-κB，并且转染细胞凋亡受到抑制。结论: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制和诱导凋亡作用；NF-κB 信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中起着促进凋亡的作用。     

构架蛋白TRAF对CD154诱导转录因子NF-κB活化的影响

目的　研究构架蛋白TRAF1-6在CD154诱导NF-κB活化信号通路中的作用机制。方法通过流式细胞仪分析TRAF蛋白在Ramos B细胞中的基础表达,转染野生型或显性失活TRAF判断TRAF对NF-κB活化的影响,并研究CD154刺激可诱导哪些TRAF蛋白与CD40免疫共沉淀。结果TRAF1、2、3、5和TRAF6在Ramos B细胞中均有基础表达,转染野生型TRAF6较其他TRAF可更显著诱导NF-κB活化,而转染显性失活质粒对CD154诱导NF-κB活化的抑制作用TRAF6>TRAF5>TRAF2> TRAF3。CD154刺激诱导TRAF2、6与CD40共沉淀。结论TRAF6在CD154诱导NF-κB活化中作用最重要;CD154刺激诱导TRAF2、6与CD40形成免疫复合物。     

环氧化酶-2特异抑制剂SC236对NF-κB活性的阻断作用

目的 探讨环氧化酶-2抑制剂的抗炎和抗肿瘤作用机理。方法 利用NF-κB报告基因暂时转染人胃上皮细胞，使用环氧化酶-2特异抑制剂SC236和PMA共同处理转染的细胞后，双重虫荧光素酶系统鉴定基因的活性。用免疫蛋白印迹法检测NF-κB亚单位IκB-α和p65的含量。结果 在人胃上皮细胞AGS和MKN28细胞内，SC236有效地抑制NF-κB介导的基因转录。SC236的作用比非特异性环氧化酶抑制剂阿斯匹林更强大。SC236与阿斯匹林的作用点不同，SC236对PMA引起的IκB-α的磷酸化或降解没有作用，SC236的作用点在于抑制065亚单位的核易位。结论 环氧化酶-2特异抑制剂的抗炎和抗肿瘤作用可能部分地通过抑制NF-κB发挥作用。特异的COX-2抑制剂抑制NF-κB活性的作用点不同于非特异的环氧化酶抑制剂。     

IGFBP-rP1对肝星状细胞活化及核因子-κB活性的影响

目的：明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBP-rP1）是否具有活化肝星状细胞（HSC）、增加细胞外基质（ECM）合成的作用；并探讨可能的信号转导途径。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）和不同浓度的 IGFBP-rP1 处理组，干预因素处理24 h后收集细胞爬片或制备单细胞悬液，采用免疫细胞化学染色观察HSC-T6中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMΑ）、I型胶原（collagen I）、纤维连接蛋白（FN）的表达变化；流式细胞仪检测HSC-T6中核因子-κB p65（NF-κB p65）的DNΑ结合活性。结果：免疫细胞化学染色结果发现，IGFBP-rP1各处理组α-SMΑ、collagen I、FN的表达均较空白对照组显著增强，且在一定范围内呈剂量依赖关系；流式细胞仪检测结果显示，IGFBP-rP1各处理组NF-κB p65阳性细胞百分数均较空白对照组明显增高。结论：IGFBP-rP1可以激活HSC，且在一定剂量范围内随着IGFBP-rP1剂量的增加HSC活化的程度逐渐增强；IGFBP-rP1可使ECM的重要组成成分collagen I和FN的合成增加；IGFBP-rP1可增强HSC中NF-κB p65的DNΑ结合活性。     

双歧杆菌对大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB和IκB的影响

目的：探讨双歧杆菌对大鼠腹腔巨噬细胞核转录因子 NF-κB和IκB调控。 方法： 收集大鼠腹腔巨噬细胞，实验分为正常对照组、双歧杆菌刺激组，以不同浓度的双歧杆菌106、107、108和109cells/L刺激细胞60 min,或以108cells/L的浓度刺激细胞不同时间(15、30、60、120和180 min)，分别收集细胞以提取总蛋白及核蛋白。用凝胶电泳迁移分析法（EMSA）测定NF-κB的结合活性；用Western印迹分析巨噬细胞胞浆内相应的IκBα蛋白表达。 结果： 双歧杆菌处理后，巨噬细胞 NF-κB向核内转移，结合活性明显增加，相应的IκBα表达降低。 结论： 双歧杆菌可以通过激活腹腔巨噬细胞核转录因子 NF-κB来发挥调作控用。     

NF-κB与COX-2的正相互作用诱导子宫颈癌细胞生长及抗凋亡

目的探讨NF—κB和COX-2通路之间的相互作用对人子宫颈癌细胞株（Hela细胞）的生长及细胞凋亡的影响。方法应用细胞计数盒（CCK-8）检测细胞存活率;Hoechst33258核染色检测凋亡细胞的形态及数量的改变：Westernblot法检测Caspase-3、NF-κB和COX-2蛋白的表达。结果应用NF．KB抑制剂（PDTC）或COX-2抑制剂（NS-398）处理Hela细胞36h能明显地抑制细胞存活率,PDTC或NS-398处理Hela细胞24h能明显地促进Caspase-3表达,并增加凋亡细胞数量。PDTC处理Hela细胞能显著地抑制COX-2表达,另方面,NS-398处理Hela细胞能抑制NF-κB的表达。结论NF-κB和COX-2通路之间的正相互作用诱导Hela细胞生长及抑制细胞凋亡。     

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.     

NF-κB超抑制物IκBαM重组腺病毒的构建

目的 在克隆IκBα基因并构建IκBαM的基础上，构建重组腺病毒AdIκBαM。方法 将IκBαM克隆至穿梭质粒，线性化后与骨架质粒共同转染BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，观察绿色荧光以确定转染结果，以Western blot法检测目的基因表达。结果 凝胶电泳及行酶切鉴定表明同源重组成功；一PCR产物测序证明确为lxBaM；以重组腺病毒质粒转染293细胞，见绿色荧光；感染293细胞得到大量病毒。结论 成功构建了IκBαM重组腺病毒，为进一步研究奠定了基础。     

过氧化物酶增殖物活化受体γ调节胰腺癌生长部分依赖于NF-κB和AP-1

目的：探讨过氧化物酶增殖物活化受体γ（PPARγ）在人胰腺癌生长中的调节作用，以及核因子-κB（NF-κB）和活化蛋白（AP-1）在该过程的变化，旨在进一步揭示PPARγ抑制胰腺癌生长的机制。 方法： 培养细胞经PPARγ配体15-脱氧-前列腺素J2（15d-PGJ2）、RXRα配体9-顺式-维甲酸（9-cis-RA）及其联合作用后，用MTT法测定细胞活力，并评价药物的抗增殖效果；用TransAMTM方法检测其对SW1990细胞中核因子-κB （NF- κB） p65活性蛋白表达的影响；用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测其对SW1990细胞活化蛋白-1（AP-1）表达的调节作用。 结果： 15d-PGJ2和9-cis-RA及其联合应用对胰腺癌细胞的增殖均具有抑制作用，且呈剂量依赖性。9-cis-RA对15d-PGJ2抑制胰腺癌细胞增殖具有协同效应。TransAMTM检测显示，15d-PGJ2、9-cis-RA及其联合作用干预组NF- κB p65活性蛋白含量均表现为先降后升的趋势，但都未达到对照组的水平。RT-PCR揭示随着15d-PGJ2、9-cis-RA及其联合作用浓度的提高，c-jun mRNA表达水平均呈现先增高后降低的趋势；在15d-PGJ2或9-cis-RA单独干预组中，c-fos mRNA表达水平逐渐减弱；而在两者联合作用组中表现为逐渐增强的趋势。 结论： PPARγ的活化在体外对胰腺癌的生长呈负调节作用。RXRα的激活可协同增强PPARγ激动剂的抗增殖作用。其机制可能是其通过下调NF-κB和AP-1表达而实现。