体外构建组织工程化肌腱的初步研究

目的探讨利用可吸收生物材料聚羟基乙酸(polyglycolic acids ,PGA)和肌腱细胞在体外构建组织工程化肌腱的可能性. 方法取肌腱细胞经体外培养、扩增至第2代,与PGA混合培养形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后分组,用U形弹簧给细胞-PGA复合物持续张力后体外培养(n=5)为实验组;没有外加张力的作为对照1组(n=4);单纯PGA作为对照2组(n=3),每2天换液1次.分别于体外培养2、4、6周取组织做组织学、免疫组化检测,同时对第6周的标本进行透射电镜和生物力学检测. 结果第2周时,3组标本在大体、组织学等方面无明显差异,组织学上主要是未降解的PGA纤维.第4周时,实验组和对照1组均有新生肌腱组织形成,HE染色和免疫组化检测均提示胶原纤维形成,而对照2组的PGA已大部分降解.第6周时,对照1组形成的肌腱组织比实验组的粗,透射电镜检测两组标本形成的胶原纤维有周期性横纹,与对照1组相比,实验组形成的胶原纤维沿纵轴排列有序更接近正常肌腱组织,生物力学检测显示实验组的最大应力(1.107±0.327 N/mm2)明显强于对照1组(0.294±0.138 N/mm2)(P<0.05). 结论应用组织工程技术在体外可以构建肌腱组织,施加周期性的应力可能更有利于肌腱组织的形成.     

组织工程化肌腱研究进展

对组织工程化肌腱领域中目前研究的主要成果进行综述，着重阐述了肌腱细胞外基质替代物、肌腱细胞生物学性质及肌腱细胞与细胞外基质材料复合研究中的主要问题。认为，研制适于肌腱细胞生长、粘附和发挥功能的细胞外基质材料；建立生长、增殖可调控的肌腱细胞系；在模拟体内力学条件下，进行肌腱细胞三维培养，将是研究具有特定修复功能的组织工程化肌腱的重要问题。     

组织工程化肌腱与正常肌腱力学强度比较

目的 比较组织工程化肌腱与正常肌腱的力学强度，为组织工程技术修复肌腱缺损提供理论参数。方法 以鸡作为实验动物，采用组织工程技术在鸡的趾腱鞘区形成肌腱组织。观察8、12、14周的大体形态和组织学。采用INSTRON生物力学测定仪测定正常肌腱与组织工程化肌腱的最大单轴抗拉力及应力-应变曲线。结果 采用组织工程技术形成的肌腱组织在术后12周其最大抗拉力可达到正常肌腱组织的63％，14周可达到正常肌腱组织的74％。应力-应变曲线显示二拉弹性模量在趾区无统计学差异。随时间推移PGA逐渐降解，胶原纤维排列逐渐与正常肌腱相似。结论 采用组织工程技术在腱鞘区构建的肌腱组织在生物力学性能上能满足机体生理功能的需要。     

采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究

目的　探索体外构建组织工程化人工血管的可行性。方法　通过酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞,培养、传代,纯化。采用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸纤维无纺网(PGA),将第3～7代血管内皮细胞接种于上述材料上,通过特制的旋转装置,缓慢动态旋转培养10天,使内皮细胞在管腔内表面附着生长,扫描电镜观察,采用6-酮-前列腺素-1α放射免疫测试药盒测定管形材料中内皮细胞释放前列环素量。结果　培养血管内皮细胞VIII因子相关抗原抗体染色呈阳性,内皮细胞在管腔内表面贴附良好,细胞之间融合成片,经10天培养,形成较完整内膜层,覆盖率为(91.2±1.5)%,前列环素生成率为（4.6±0.5）μg/cm     

组织工程人工肌腱的实验研究

目的 为构建组织工程肌腱积累经验。方法 应用显微外科技术剥除人胚肌腱外膜组织后,经过胰蛋白酶及胶原酶分步消化分离出人胚腱细胞,使用Ｆ１２培养液将其传代培养。该细胞贴壁生长,接触抑制的性质。细胞群体倍增时间大致为４ｄ。通过冻存后复苏的细胞继续培养后发现,冻存对其生长、形态、遗传学等特征无明显影响。经测定培养细胞分泌的羟脯氨酸含量,证实培养的人胚腱细胞与体内腱细胞同样具有合成胶原的能力,并且这种能力不     

蚕丝组织工程肌腱修复肌腱缺损的实验性研究

[目的]探讨用蚕丝与同种异体肌腱细胞联合培养植入体内,构建组织工程化肌腱的可行性。[方法]以罗曼鸡为实验对象分两组,术后第2、4、6、8周进行病理学检查、生物力学和拉伸度的测定。数据采用SPSS 13.0进行统计分析。[结果]细胞组在胶原的合成以及力学检测均明显优于非细胞组(P0.05)。[结论]本实验的结果说明蚕丝材料对肌腱细胞的吸附明显,降解缓慢,抗拉性能优越,构成组织工程化肌腱,可能会在肌腱缺损的治疗方面发挥出巨大潜能。     

组织工程化肌腱体外构建的环境优化及系统设计

目的 设计一套构建具有一定功能和形态的肌腱组织的体外培养方法。方法 根据肌腱细胞体内的生物力学环境，在细胞的培养过程中，设计一套能够提供张力和参数测量系统的生物反应器，在肌腱的培养过程中对肌腱施加不同形式的张应力作用，以期在体外获得力学性能优化的自体肌腱。结果 细胞培养和张应力控制系统是由完全透明的有机材料制成的，整个系统由细胞培养室、测量系统和排换液系统等部分构成，在长期的肌腱细胞培养中，可提供肌腱一材料支架动态的培养方式。细胞培养室能很方便与气动肌腱连接，产生持续的脉冲张力作用。结论 用肌腱生物反应器可以使肌腱组织复合物在形成过程中始终处于力学环境中，促进肌腱组织中胶原纤维的平行排列，提高肌腱的力学性能，为组织工程化肌腱的产业化提供一种新的方法。     

肌腱组织工程研究新进展

组织工程化肌腱原理是将分离的高浓度有活力的肌腱种子细胞种植于生物相容性好，可生物降解的细胞载体中，体外培养后植到缺损部位，形成新的、自身的，具有功能的肌腱组织，最终达到生物学意义上的完全修复。现就肌腱组织工程中肌腱细胞的特征、种子细胞来源、支架材料的制备、临床应用和面临的问题和展望等做一综述。     

应用脂肪干细胞构建组织工程化小口径血管平滑肌层的实验研究

目的探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性。方法用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于PGA上,将细胞-材料复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率:75次/分;扩展量<5%),构建小口径的血管平滑肌组织。培养8周后,取材行组织学和生物力学检测并与正常血管对比。结果脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞呈现平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC;反应器内培养8周后,构建的管状组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性。结论利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管平滑肌层,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的可能的途径。     

自体肌腱细胞介导修复肌腱缺损的实验研究

目的　探讨以自体肌腱细胞为种子细胞的组织工程化肌腱体内形成。方法　取自体肌腱细胞经体外培养、扩增 ,与可吸收生物材料聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)混合培养形成细胞 生物材料复合物 ,将细胞 生物材料复合物移植于手术缺损的家猪趾浅屈肌腱处 ,并设单纯PGA组作为对照组。术后 6周取材 ,对标本进行大体观察、组织学和生物力学检测和评价再生组织。结果　实验组新生组织在大体、组织学和胶原排列等方面与正常肌腱相似 ,对照组新生组织细胞、胶原排列较为紊乱。生物力学显示其最大拉力、最大应力和弹性模量 ,实验组比对照组分别提高 3 6.1% (t =3 5 6、P <0 .0 5 )、2 7.4%(t =2 94、P <0 .0 5 )和 15 .0 % (t =2 62、P <0 .0 5 )。结论　应用组织工程技术以自体肌腱细胞可以修复肌腱缺损     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。     

Repair of acutely injured spinal cord through constructing tissue-engineered neural complex in adult rats

Objective： To construct tissue-engineered neural complex in vitro and study its effect in repairing acutely injured spinal cord in adult rats. Methods： Neural stem cells were harvested from the spinal cord of embryo rats and propagated in vitro. Then the neural stem cells were seeded into polygiycolic acid scaffolds and co-cultured with extract of embryonic spinal cord in vitro. ce histochemistry and scanning electron microscope were used to observe the microstructure of this complex. Animal model of spine semi-transection was made and tissue-engineered neural complex was implanted by surgical intervention. Six weeks after transplantation, functional evaluation and histochemistry were applied to evaluate the functional recovery and anatomic reconstruction. Results： The tissue-engineered neural complex had a distinct structure, which contained neonatal neurons, oligodendrocytes and astrocytes. After tissue-engineered neural complex was implanted into the injured spinal cord, the cell components such as neurons, astrocytes and oligodendrocytes, could survive and keep on developing. The adult rats suffering from spinal cord injury got an obvious neurological recovery in motor skills. Conclusions： The tissue-engineered neural complex appears to have therapeutic effects on the functional recovery and anatomic reconstruction of the adult rats with spinal cord injury.     

组织工程舌黏膜构建的研究

目的 探讨舌黏膜细胞的体外培养方法,及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物(BAMG)复合构建组织工程化黏膜的方法.方法 分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养,定期观察细胞形态变化及生长增殖情况.对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比;细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法测定以判断细胞增殖能力.取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG,随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果,然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上,通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况.结果 舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代,传至第4代时开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱.免疫荧光染色显示近100%体外培养的舌黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性.流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比大于96%.舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×107以上.HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好.结论 兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增;兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好.     

衍生肌腱支架材料的细胞相容性研究

目的 探讨衍生肌腱支架材料（tendon derivation biomaterials，TDBM）与肌腱细胞的细胞相容性及肌腱细胞在此三维支架上培养的生物学行为，为肌腱组织工程新型支架材料的应用提供依据。方法将肌腱细胞与TDBM体外复合培养，设置单纯肌腱细胞培养为对照组，进行形态学观察，并检测细胞增殖、细胞周期、细胞DNA倍体水平及肌腱细胞凋亡率。通过^3H-脯氨酸（^3H-Proline）掺入试验了解材料对肌腱细胞胶原合成的影响。结果 肌腱细胞在TDBM上呈梭形生长，TDBM组细胞第2天进入对数增长期，倍增时间为3d，而单纯肌腱细胞培养对照组倍增时间为3．75d。TDBM组与单纯肌腱细胞培养对照组比较，^3H-Proline掺入值差异无统计学意义（P〉0．05），说明细胞功能未受影响。与支架材料复合培养的肌腱细胞DNA指数为0．96，增殖指数较对照组高10．1％，提示肌腱细胞在三维胶原支架上生长速度快，增殖能力强。结论TDBM具有良好的细胞相容性，可作为肌腱细胞的有效载体应用于组织工程化肌腱的构建。     

ptsA58H质粒转化人胚腱细胞的生物学特性研究

目的 研究经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转染的转化人胚腱细胞的生物学特性及致瘤性。方法 体外培养转化人胚腱细胞，对细胞进行形态学、超微结构及一般特征的观察。绘制细胞生长曲线，平板克隆实验检测克隆形成率，软琼脂培养，植入鼠体内观察有无致瘤性，Ｂｒｄｕ标记细胞，检测细胞植入体内的转归及细胞的分泌功能。结果 转化人胚腱细胞能４长期传代，增殖能力强，在软琼脂中不生长，接种裸鼠不致瘤。且在裸鼠体内细胞存活，增殖能力旺     

自体骨膜包裹肌腱对腱骨愈合的影响

目的探讨自体骨膜包裹肌腱植入骨隧道是否会加速移植肌腱与骨隧道之间界面的愈合。方法60只健康新西兰白兔，随机编号，平均分为3组，每组20只，即骨膜包绕肌腱生发层朝向骨组、骨膜包绕肌腱生发层朝向肌腱组、肌腱无骨膜包绕组（对照组）。对照组以兔躅长屈肌腱和跟骨建立腱骨固定模型，分别于术后1、2、3、4、6周取标本进行光镜观察，并进行生物力学测试。结果骨膜生发层朝向骨组术后3周即有明显的骨膜成骨，而生发层朝向肌腱组及对照组均无新骨生成。4周生发层朝向骨组，新生骨小梁较另外两组显著增多。6周时生发层朝向骨组，新生骨小梁的数量以及与肌腱结合的紧密程度均明显优于生发层朝向肌腱组和对照组。生物力学测试，通过单因素方差分析及两两比较的g检验，生发层朝向骨组与另外两组比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05），而生发层朝向肌腱组与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论自体骨膜包裹肌腱且生发层朝向骨可缩短成骨时间，加速腱骨愈合。     

人真皮成纤维细胞体外构建组织工程化软骨的初步探索

目的 利用软骨细胞提供的体外软骨诱导微环境,探讨人真皮成纤维细胞在体外构建软骨的可行性.方法 分别培养猪的软骨细胞与人真皮成纤维细胞,将2种细胞按1:1(软骨细胞:成纤维细胞)比例混匀,以5.0×10~7/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸支架(PGA,直径9 mm,高2mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯成纤维细胞分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照.每组各接种3个标本,每个接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、组织学及免疫组化等相关检测对构建软骨进行评价.结果 软骨细胞组(阳性对照组)基本保持了复合物初始的大小和形状,组织周边和中央均有较均质的软骨陷窝样结构形成,表达软骨特异性细胞外基质;共培养组的组织稍有缩小,组织周边也有软骨陷窝样结构形成,表达软骨特异性细胞外基质,但组织内大部分区域形成了纤维样组织,特别是通过人核抗原免疫组化和对应的Safranin O染色结果,可以看到少量人核抗原阳性的细胞形成了较成熟的陷窝样结构,表达软骨特异性基质.单纯成纤维细胞组(阴性对照组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,未形成软骨样组织.结论 软骨细胞共培养体系可以有效地诱导人真皮成纤维细胞中一定比例的细胞向软骨分化,并能在体外构建软骨样组织.     

转化人胚腱细胞致瘤性实验研究

目的研究用SV40温度依赖株质粒ptsA58H转化人胚腱细胞是否具有致瘤性。方法采用不同梯度细胞密度(5×10