生长抑制DNA损伤基因45与p53对卵巢癌细胞凋亡作用的研究

目的：研究生长抑制ＤＮＡ损伤基因（ｇｒｏｗｔｈａｒｅｓｔａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅ,ＧＡＤＤ）对卵巢癌细胞的作用及与ｐ５３蛋白表达的关系。方法：利用ＲＴ－ＰＣＲ鉴定卵巢癌ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ＧＡＤＤ４５的表达;采用ＲＴ－ＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ｐ５３蛋白的表达。通过载体构建将目的基因ＧＡＤＤ４５重组于ｐｃＤＮＡ－Ⅲ真核质粒内。利用脂质体（ＤＯＴＡＰ）法转染ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株;Ｇ４１８抗性筛选,ＲＴ－ＰＣＲ进行表达鉴定。采用流式细胞仪分析（ＦＣＭ）以及ＤＮＡ梯度法对细胞凋亡现象进行检测。结果：卵巢癌ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ＧＡＤＤ４５表达阴性。ＳＫＯＶ３细胞株ｐ５３蛋白表达阳性;３ＡＯ细胞株ｐ５３蛋白表达阴性。转染ＧＡＤＤ４５基因的ＳＫＯＶ３细胞株经化学药物足叶已甙（ＶＰ１６）和紫外线诱导后,可以使该细胞产生凋亡现象,而对转染ＧＡＤＤ４５基因的３ＡＯ细胞株经诱导后,未见细胞凋亡现象。结论：转染ＧＡＤＤ４５基因,对ｐ５３蛋白表达阳性的细胞株ＳＫＯＶ３经诱导后,可使细胞进入凋亡状态。对ｐ５３蛋白表达阴性的细胞株３ＡＯ转染ＧＡＤＤ４５基因后,经诱导细胞无凋亡现象,证实ＧＡＤ?     

p53基因转染对卵巢癌MDR细胞药物敏感性及恶性表型的影响

目的研究p53基因导入已知内源背景的肿瘤MDR细胞所致的恶性表型和MDR表型的改变及两者的关系.方法用磷酸钙沉淀法将含有野生型及全长反义p53cDNA的逆转录病毒戴体pDWp53及pDAp53转染病毒包装细胞PA317,测定病毒滴度.用此病毒感染卵巢癌多药耐药细胞株A2780/ADM,SouthernBlot鉴定,检测转导基因后细胞株的恶性度、多药耐药性等情况.结果野生型及反义全长p53cDNA均转入PA317细胞获得效价为(1～1.5)×105CFU/ml的前病毒,以此感染卵巢癌多药耐药细胞株A2780/ADM,SouthernBlot证实p53基因导入该细胞并整合到基因组DNA中,进一步测试观察到①导入野生型p53基因的A2780/ADM细胞生长被抑制、恶性度降低,细胞形态和生长曲线改变,软琼脂集落形成率及裸鼠接种成瘤率降低;②细胞多药耐药性减弱,对ADM耐药性下降,P-gp表达降低;③反义p53的导入也对A2780/ADM恶性度有一定的影响;④野生型p53导致的MDR细胞恶性表型与MDR水平的降低似有平行关系.结论p53基因对肿瘤细胞mdr-1基因的表达可能起调控作用,p53发生突变的MDR细胞内导入野生型p53在一定程度上可逆转MDR,为p53导入肿瘤细胞在分子水平上逆转耐药提供了直接的实验依据.     

野生型p53基因对人卵巢癌细胞株的生长抑制作用

目的：探讨野生型ｐ５３(ｗｔ ｐ５３)基因对人卵巢癌细胞株的生长抑制作用。方法：利用脂质体介导，将含有人全长ｗｔ－ｐ５３基因ｃＤＮＡ的真核表达载体质粒ｐＣＥＰ４／ｐ５３和空载体质粒ｐＣＥＰ４分别转染卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞株，分别命名为ＳＫＯＶ３－ｐＣＥＰ４／ｐ５３细胞(C组)、ＳＫＯＶ３－ｐＣＥＰ４细胞(B组)，另设ＳＫＯＶ３细胞为正常对照组（Ａ组）。观察细胞体外生长情况和凋亡变化。结果：外源性ｐ５３基因在Ｃ组细胞中获表达，细胞生长曲线显示ｐ５３的导入使ＳＫＯＶ３细胞生长受到明显抑制，Ｃ组平均细胞集落数（１８．６±１．８个）少于Ａ组（２４．３±２．２个）和Ｂ组（２２．７±２．６），差异有显著性（Ｐ（005）。ＭＴＴ法检测C组细胞活力明显低于Ａ、Ｂ组。Ｃ组细胞Ｇ０～Ｇ１期百分比（５７．７９％）及凋亡细胞百分比（13．９1％）均高于Ｂ组（４６．０２％、２．０８％）和Ａ组（４３．６２％、０）。结论：ｗｔ－ｐ５３基因可介导ＳＫＯＶ３细胞Ｇ１期停滞和细胞凋亡，抑制细胞体外生长。     

异搏定等药物对耐阿霉素人卵巢癌细胞系逆转耐药性的研究

目的：探讨异搏定、潘生丁、丹参、黄体酮、环孢菌素Ａ和他莫西芬等药物对耐阿霉素人卵巢癌细胞系Ａ２７８０／ＡＤＭ逆转的耐药性。方法：用ＭＴＴ法和高效液相色谱仪测定异搏定等６种药物分别对阿霉素耐药细胞的敏感性和耐药细胞内阿霉素的剂量。结果：单用异搏定等６种药物对Ａ２７８０／ＡＤＭ几乎无体外抑制作用。异搏定和环孢菌素Ａ对Ａ２７８０／ＡＤＭ有明显的增效作用，可增加ＡＤＭ在Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞内的潴留浓度。结论：除丹参外，其它５种药物均能增强ＡＤＭ对Ａ２７８０／ＡＤＭ耐药细胞细胞毒作用，并克服ＡＤＭ的耐药性，可作为ＡＤＭ的增效剂用于临床治疗卵巢癌患者     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢癌细胞的杀伤…

目的：探讨包疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因转染联合抗病毒药物羟基无环鸟苷（ＧＣＶ）对人卵巢癌细胞系的杀伤效应。方法：采用基因工程技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因的ＤＮＡ序列插入逆洋病毒载体ｐＬＮＳＸ的ＨｉｎｄⅢ位点，构建重组体ｐＬＮＳ／ＨＳＶ＝ＴＫ，并采用磷酸钙介导贴壁细胞基因转染法将重组体导入ＰＡ３１７我装细胞，建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株ＰＡ３１７／ＴＫ。并采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测ＨＳＶ－     

野生型p53基因cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响

目的：研究野生型ｐ５３基因ｃＤＮＡ转染对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ－３生物学行为的影响。方法：用脂质体介导的转染技术，将含有全长人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ的真核表达重组质粒和空载体质粒，分别导入不表达ｐ５３的ＳＫＯＶ－３细胞，观察细胞生物学行为的改变。结果：（１）共获２个ｐ５３ｃＤＮＡ转染克隆（ｐＣ５３）和２个空载体转染克隆（ｐＮｅｏ）；（２）ｐＣ５３和ｐＮｅｏ细胞形态学与ＳＫＯＶ－３无显著差别；（３）ｐＣ５３细胞生长明显比ＳＫＯＶ－３慢，而ｐＮｅｏ细胞生长与ＳＫＯＶ－３相当；（４）ｐＣ５３在软琼脂中形成集落数显著少于ＳＫＯＶ－３细胞和ｐＮｅｏ细胞；（５）ｐＣ５３Ｇ１／Ｇ０期细胞百分比高于ＳＫＯＶ－３和ｐＮｅｏ。结论：野生型ｐ５３ｃＤＮＡ可作为卵巢癌基因治疗的目的基因之一。     

多药耐药基因表达与卵巢癌耐药关系的研究

目的：探讨多药耐药（ＭＤＲ１）基因表达与卵巢癌耐药的关系以及耐药修饰剂——环孢素Ａ（ＣｓＡ）对卵巢癌耐药性的逆转影响。方法：建立裸鼠卵巢癌模型，随机分为对照组、阿霉素（ＡＤＭ）组、ＡＤＭ＋ＣｓＡ组，观察３组的肿瘤生长情况以及生存率。利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测３２例卵巢癌患者肿瘤组织ＭＤＲ１基因的表达情况。结果：ＭＤＲ１基因表达阳性的卵巢癌细胞对阿霉素、柔红霉素、足叶乙甙、长春新碱等多种化疗药物交叉耐药，其５０％细胞抑制浓度（ＩＣ５０值）是ＭＤＲ１基因表达阴性细胞的４．１～１５．５倍。当ＡＤＭ与ＣｓＡ联合应用后，裸鼠肿瘤生长速度与单用ＡＤＭ者之间的差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。３２例卵巢癌患者ＭＤＲ１基因表达与卵巢癌的病理类型、分化程度之间没有明显的关系，而ＭＤＲ１基因表达阳性患者预后不良的机率是阴性患者的１６．０７（１．７６～１４４．７）倍。结论：ＭＤＲ１基因相关药物可以诱导ＭＤＲ１基因的过度表达，出现多药耐药的表型。ＣｓＡ可以在体外环境及动物体内环境中部分逆转卵巢癌细胞的耐药性。在卵巢癌患者中检测ＭＤＲ１基因的表达，可以作为判断临床预后的一个指标。     

c—erbB2反义核酸对卵巢癌细胞系生物学行为及药物敏感性的影响

目的：探讨ｃ－ｅｒｂＢ２反义核酸对卵巢癌细胞生物学行为及其化疗药物敏感性的影响。方法：应用ｐＵＣ－ｅｒｂＢ２和ｐＤＯＲ－ｎｅｏ质粒，构建了含反义ｅｒｂＢ２ｃＤＮＡ３．８ｋｂ的重组逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ－ｅｒｂＢ－ｎｅｏ，经脂质体转染ｅｒｂＢ２高表达的人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３，再经Ｇ４１８（一种新霉素类似物）筛选得到新霉素抗性细胞，命名为ＳＫＯＶ３－Ａ２。结果：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析表明，反义ｅｒｂＢ２３．８ｋｂ已完全整合到ＳＫＯＶ３细胞中，与亲本细胞及转染ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的对照组细胞相比，ＳＫＯＶ３－Ａ２的生长和ＤＮＡ合成均受到抑制，且对５－氟尿嘧啶（５－ＦＵ）及顺铂（ＤＤＰ）的药物敏感性明显增加。结论：ｃ－ｅｒｂＢ２反义核酸在卵巢癌基因治疗中有一定作用；ｃ－ｅｒｂＢ２癌基因可能与卵巢癌细胞耐药有关。     

异搏定等药物地耐阿霉素人卵巢癌细胞系逆转耐药性的研究

目的：探讨异搏定，潘生丁，丹参，黄体酮，环孢菌素Ａ和他莫西芬等药物对耐阿霉素人卵巢癌细胞系Ａ２７８０／ＡＤＭ逆转的耐药性，方法；用ＭＴＴ法和高效液相色谱仪测定异搏定等６种药物分别对可霉素耐药细胞的敏感性和耐药细胞内阿霉素的剂量。结果：单用异搏定等６种药物对Ａ２７８０／ＡＤＭ几乎无体外抑制作用，异搏定和环孢菌素Ａ对Ａ２７８０／ＡＤＭ有明业的增效作用，可增加ＡＤＭ在Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞内的潴留浓度，     

野生型p53基因cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV—3生物学行为的…

目的：研究野生型ｐ５３基因ｃＤＮＡ转染对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ－３生物学行为的影响，方法：用脂质体介导的转染技术，将含有全长人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ的真核重组质粒和空载体质粒，分别导入不表达ｐ５３的ＳＫＯＶ－３细胞，观察细胞生物学行为的改变。结果；（１）共获２个ｐ５３ｃＤＮＡ转染克隆（ｐＣ５３）和２个空载体转染克隆（ｐＮｅｏ）；（２）ｐＣ５３和ｐＮｅｏ细胞形态学与ＳＫＯＶ－３无显著差别，（３）ｐＣ５３     

不同蛋白激酶C同工酶亚型对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的 :检测不同的蛋白激酶 (PKC)同工酶亚型在人卵巢癌耐药细胞中的表达和功能 ,探讨它们与P 糖蛋白 (P gp)介导的多药耐药性之间的关系。方法 :采用免疫荧光及免迹印迹方法检测PKCα和PKCβI在人卵巢A2 780细胞和A2 780 /ADM耐药细胞中的表达 ,免疫印迹法检测P gp的表达 ,并用流式细胞仪测定细胞内柔红霉素 (DNR)及罗丹明 1 2 3 (Rh1 2 3 )的荧光强度。结果 :在A2 780 /ADM细胞中 ,PKC与P gp的表达较A2 780细胞增高 ,PKCβI表达在两者间无明显改变 ;在A2 780 /ADM中DNR及Rh1 2 3的荧光强度较A2 780中降低。A2 780 /ADM细胞与抗PKCα抗体共同卵孕育后细胞内DNR含量上升 ,与十字孢碱 (SP)作用后细胞内Rh1 2 3泵出减少 ,积聚量升高。结论 :PKCα可能在P gp介导的人卵巢癌细胞多药耐药中起重要作用     

人卵巢癌细胞阿霉素耐药株的建立及其耐药机制的研究

目的：建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对阿霉素的耐药特征和机制。万法；应用浓度递增和短时间作用法，从人卵巢癌细胞A2780中培养出对阿霉素耐药细胞亚株（A2780／ADM）。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性，用高效液相色谱仪捡测耐药细胞内阿霉素含量，以及应用RT-PCR法和免疫组化法检测MDR1和GST－π的表达情况。结果：（1）A2780／ADM对ADM的耐药指数为38．2，而且其倍增时间较A2780细胞延长，对VCR、MTX呈高度耐药状态，对KSM、CARP、PYM、VP16、CTX和5－FU均有不同程度的耐药。（2）耐药细胞内阿霉素含量明显低于A2780细胞。（3）耐药细胞MDR1的表达呈阳性，而GST－π只有在高浓度的耐药细胞内才呈弱阳性。结论：A2780细胞对阿霉素的耐药是获得性的，并呈多药耐药特征，其耐药的主要原因是细胞内MDR1的过度表达，导致药物在耐药细胞内浓度降低。此项研究结果有助于卵巢癌患者化疗选用药物时作为参考。     

白细胞介素6诱导卵巢上皮性癌细胞对化疗药物产生耐药的机制研究

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)诱导卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞对化疗药物产生耐药的机制及相关信号传导通路.方法 应用外源性重组IL-6短期处理或将正义IL-6基因(ssIL-6)稳定转染至A2780细胞(不表达IL-6但表达其受体、对顺铂和紫杉醇敏感),同时将反义IL-6基因(asIL-6)稳定转染至SKOV3细胞(高表达IL-6及其受体、对顺铂和紫杉醇耐药),应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、逆转录PCR(RT-PCR)技术及蛋白印迹法(western blot)观察IL-6是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对可能的信号传导通路进行研究.结果 (1)外源性重组IL-6处理A2780细胞后,对顺铂和紫杉醇的耐药倍数分别为6.25和7.31倍;ssIL-6转染A2780细胞后(内源性过表达IL-6),IL-6低、中、高表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为7.13、7.47和8.34倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为7.61、8.27和10.70倍;而asIL-6转染SKOV3细胞后(抑制内源性IL-6表达),IL-6中、高抑制表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为0.15和0.10倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为0.10和0.08倍,可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性.(2)外源性IL-6作用后,上调了A2780细胞中耐药相关基因MDR1和GST-π以及凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL和XIAP mRNA和蛋白的表达;与此相一致,ssIL-6转染的A2780细胞中MDR1、GST-π及bcl-2、bcl-xL、XIAP mRNA和蛋白的表达水平增加,而asIL-6转染的SKOV3细胞则明显降低.(3)有丝分裂原活化的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂--PD98059和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂--wortmannin能分别阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)的活化作用,且两者均能阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生的耐药,细胞生长明显减少.结论 IL-6诱导的卵巢癌细胞化疗耐药很可能与其上调卵巢癌细胞耐药相关基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL、XIAP的表达以及活化MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路有关.     

MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组）,空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）,RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达,蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后,MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8,显著高于空载体组的40．2±1．6,差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后,A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％,均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

Over-expression of PTEN sensitizes human ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis in a p53-dependent manner

OBJECTIVE: Resistance to cisplatin-centered chemotherapy is a major cause of treatment failure in human ovarian cancer. Whereas PTEN, a tumor suppressor gene product, is believed to promote apoptosis primarily via inactivation of the PI3K/Akt cell survival pathway, recent evidence suggests that PTEN may function independently of this pathway. Activation of p53 is a key determinant of sensitivity to cisplatin-induced apoptosis. Whether PTEN can facilitate cisplatin sensitivity, and this involves the activation of p53, remains unclear. In this study, we determined whether and how PTEN over-expression sensitizes ovarian cancer cells to CDDP-induced apoptosis. METHODS AND RESULTS: Using pairs of chemosensitive and chemoresistant ovarian cancer cell lines (OV20028 vs. C13* and A2780-s vs. A2780-cp) as an in vitro model, we have examined the influence of PTEN over-expression in regulation of cisplatin-induced apoptosis. Apoptosis was assessed morphologically by Hoechst staining and confirmed by the detection of cleaved products of caspase-3 and PARP by Western blot. Over-expression of PTEN by PTEN cDNA transfection up-regulates p53 content and increases the sensitivity of chemoresistant cells to cisplatin-induced apoptosis without detectable changes in the levels of phosphorylated Akt and FKHR as well as FasL mRNA abundance as determined by Western blot and RT-PCR, respectively. PTEN-mediated chemosensitization was attenuated by p53 down-regulation by siRNA in C13*, a chemoresistant wild-type p53 cell. Moreover, PTEN over-expression failed to sensitize the chemoresistant p53 mutant ovarian cancer cell line A2780-cp to cisplatin-induced apoptosis, unless wild-type p53 was reconstituted by adenoviral p53 infection. CONCLUSION: Taken together, these data suggest that PTEN over-expression may represent a novel therapeutic approach for chemoresistant human ovarian cancer and that this may involve a p53-mediated apoptotic cascade independent of the PI3K/Akt pathway.     

mda-7/IL-24基因对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的:探讨抑癌基因mda-7/IL-24对卵巢癌细胞株A2780和耐药株A2780/ DDP耐药性的影响。方法:构建人mda-7/IL-24基因重组腺病毒,感染A2780和A2780/ DDP的两种卵巢癌细胞株,MTT法检测细胞感染对顺铂(DDP),阿霉素(ADM),5-氟尿嘧啶(5-FU),泰素(Taxol)4种化疗药物敏感性的变化。结果:重组腺病毒载体Ad．mda-7/ IL-24经测序、酶切电泳检测正确;感染后A2780细胞对DDP、5-FU、Taxol的耐药性降低, DDP的药物敏感性提高了15．45倍,5-FU和Taxol的药物敏感性分别提高了2．15倍和3．63倍;A2780/DDP细胞对5-FU药物敏感性提高了2．62倍。结论:成功构建了Ad．mda-7/IL-24重组腺病毒载体,感染卵巢癌细胞A2780可提高对DDP、5-FU和Taxol的敏感性。     

MDM2 sensitizes a human ovarian cancer cell line

OBJECTIVES: The purpose of this study was to determine whether overexpression of MDM2 could sensitize the ovarian cancer cell line A2780. METHODS: The wild-type p53-expressing cell line A2780 was stably transfected with pCMV-MDM2 (A2780-MDM2) or pCMV (A2780-V) as control. MTT assay and clonogenic survival assay were used to measure the cisplatin sensitivity. FACS and host cell (CAT) reactivation assay were used to estimate the change of cell cycle and ability of repairing cisplatin-induced DNA damage. RESULTS: Parental A2780 and A2780-V had similar cisplatin sensitivities, whereas A2780-MDM2 was two- to threefold more sensitive to cisplatin. Repair of cisplatin-induced DNA damage was reduced in A2780 cells overexpressing MDM2, compared to A2780 cells in which wild-type p53 function was intact. After cisplatin treatment, A2780-MDM2 cells showed a pronounced S-phase arrest; however, A2780 cells with intact wild-type p53 arrested primarily in G2/M phase. CONCLUSIONS: MDM2 overexpression can increase cisplatin cytotoxicity in A2780, with loss of G1/S checkpoint control and decreased cisplatin-DNA adduct repair. This suggests that ovarian cancers that overexpress MDM2 may be amenable to treatment with platinum compounds.     

重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转导及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用

目的探讨重组慢病毒介导的体外转导OPCML基因的可行性及其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的抑制作用。方法采用PCR技术,用基因特异性引物将OPCML基因的cDNA从CD1小鼠脑组织中扩增,并将OPCML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI OPCML;将pWPI OPCML或pWPI GFP(空载体对照)质粒和包装质粒pCMVdR8.74、pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPCML和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒WPI OPCML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI GFP;用重组慢病毒WPI OPCML和WPI GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、OCC1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系CD1细胞,以未转染任何基因者为空白对照。通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察OPCML基因对卵巢癌细胞的抑制作用。结果(1)OPCML基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,并稳定表达;蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPCML和GFP蛋白均有表达。(2)细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPCML基因72h后的A2780/OPCML细胞为(7.6±1.0)×105个,明显少于未转导基因的A2780细胞或仅转导空载体的A2780/pWPI细胞[分别为(20.0±2.6)×105和(18.1±1.7)×105个;P<0.01];但OCC1和CD1细胞中,OPCML基因对细胞的增殖无明显的影响(P>0.05)。(3)细胞周期分析显示,OPCML基因对A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用(转导前、后G0～G1期细胞分别为67%、75%;P<0.05),但对OCC1、CD1细胞则无明显阻滞作用(P>0.05)。(4)细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPCML基因能明显增强细胞的黏附力(P<0.05)。(5)移植瘤实验显示,将A2780/OPCML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10mg,显著低于注射A2780、A2780/pWPI细胞的裸鼠[各4只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为(280±53)及(677±323)mg;P<0.01]。免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPCML蛋白有表达。结论用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达。OPCML基因能够增加A2780细胞的黏附能力,抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPCML基因可能是一个新的抑癌基因。     

The influences of interleukin-1 beta converting enzyme expression on the biologic characteristics of ovarian cancer cells

OBJECTIVE: To investigate the effects of interleukin-1 beta converting enzyme (ICE) gene on the biologic characteristics of ovarian cancer cells. METHODS: A 1.3 Kilobase human ICE cDNA with 5' and 3' untranslated sequences was cloned into the EcoR I site of pLXSN retrovirus vector in sense orientation. After that, the recombinant plasmid pLXSN-ICE was transferred to virus-packing cell PA317 by electroporation method. And then the retrovirus containing human ICE cDNA generated by these PA317 cells were used to transfect human ovarian cancer cell lines, AO and 3AO. RESULTS: After being transfected with these retrovirus, the number of the clones obtained after G418 resistance selection is far less than that of controlled groups with plasmid pLXSN. The growth rate of these transfected cells was significantly suppressed in comparison with the parental cell line. Apoptosis was also found in these cells. After the transfection cancer cells were inoculated subcutaneously in nude mice, the tumor growth was significantly inhibited. CONCLUSION: It suggest that human ICE gene can suppress the phenotype and tumorigenicity in nude mice of ovarian cancer cell lines AO and 3AO.