鸟苷酸解离抑制因子-2 真核表达载体构建及稳定转染A549 细胞株 的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。     

含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5真核表达载体的构建及初步功能研究

目的 构建含小鼠FNDC5基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-FNDC5,并初步探索其对C2C12肌细胞的线粒体能量代谢的影响。方法 应用反转录-聚合酶链反应法从小鼠腓肠肌和心脏组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的FNDC5编码片段,经回收、纯化酶切后,依次连接到质粒PMD19-T和pEGFP-C3上,获得过表达载体后转染至C2C12肌细胞,48h后以激光共聚焦显微镜拍摄线粒体荧光强度,以荧光定量PCR检测与线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达情况。结果 PCR及测序结果表明:重组质粒pEGFP-C3含有FNDC5段,方向及大小正确,过表达FNDC5可以增强线粒体荧光强度,并增加线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达。结论 成功构建了小鼠真核表达载体pEGFP-C3-FNDC5,过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及其在人舌鳞癌SCC-4细胞系中的表达

［摘要］ 目的：构建抑癌基因PTEN真核表达载体pEGFP-PTEN,并观察其在人舌鳞癌scc-4细胞系中的表达,为舌鳞癌的基因治疗提供理论依据。方法：提取人HeLa细胞总RNA,采用RT-PCR法获取PTEN全基因,克隆至pMD18-T载体,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-PTEN重组质粒。双酶切及测序鉴定后,经脂质体介导转染至体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达;Western blotting法检测细胞内PTEN蛋白的表达。结果：pEGFP-PTEN重组质粒双酶切,克隆的目的基因片段约为1 200 bp,测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致;荧光显微镜下观察到pEGFP-PTEN在SCC-4细胞系中成功表达;Western blotting结果,转染组PTEN蛋白表达强度为1.07±0.15,与空转染组（0.62±0.11）和未转染组（0.57±0.08）比较差异有统计学意义（P<0.05)。结论：成功构建pEGFP-PTEN重组真核表达载体,该载体能在人舌鳞癌SCC-4细胞系中表达。     

A20基因在神经母细胞瘤细胞系中的抗凋亡作用

目的 A20基因是一种肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导下的原始反应基因.其编码的锌指结构蛋白在押制NF-kB和TNF-α介导的细胞凋亡方面得到了广泛的研究.但对于其在神经系统中的作用研究较少.该实验采用脂质体转染及克隆筛选将A20基因导入神经母细胞瘤(SY-SH-5Y细胞系)中,通过体外实验观察A20-SY-SH-5Y细胞在抗凋亡方面的表现.方法 SY-SH-SY细胞系转染A20基因后.应用肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激,采用流式细胞仪(FACS)测定细胞的死亡率.并进行DNA片断化分析(DNA Ladder).结果 实验表明:转染A20的SY-SH-5Y细胞系在TNF-α的诱导下死亡率小于对照组转染pCDNA3基因的SY-SH-5Y细胞系(P<0.05).结论 A20作为一种在细胞抗凋亡过程中发挥关键作用的基因,能够在神经母细胞瘤SY-SH-5Y细胞系中表现出较强抗凋亡能力,为临床上许多以凋亡为主要表现的神经系统疾病的治疗提供了新思路.     

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10⁸ TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44,P=0.0076）。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374,P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

三氧化二砷对人肺腺癌A-549细胞株增殖及c-Myc基因表达的影响

目的观察三氧化二砷(As2O3)对人肺腺癌A549细胞株的生长增殖、细胞周期、凋亡等方面的影响,并初步探讨其机制。方法选用不同浓度As2O3处理人肺腺癌A549细胞株,以MTT比色法检测细胞生长增殖的抑制情况;用流式细胞术测定细胞周期、凋亡率;以免疫组织化学法分析不同浓度As2O3对c-Myc基因表达的影响。结果 As2O3以时间和浓度依赖的方式抑制人肺腺癌A-549细胞的增殖,并能诱导细胞凋亡。不同浓度As2O3处理组可调控细胞周期分别发生G2/M期阻滞和S期阻滞,并下调c-Myc基因表达。结论三氧化二砷对人肺腺癌细胞株A-549的生长、增殖有明显抑制作用,其机制可能与细胞周期阻滞和抑制c-Myc基因的表达和诱导细胞凋亡有关。     

人野生型survivin-1基因重组载体的构建及其在A549中的表达

目的克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin异构体之一Survivin-1（SVV-1）基因的编码序列，构建含SVV-1基因的真核细胞表达载体并在肺腺癌细胞系A549中高表达，为进一步研究该基因在肺腺癌发病中的作用奠定基础。方法根据已发表的SVV-1基因的核苷酸序列自行设计一对分别合有BamHⅠ和XhoⅠ双酶切住点的survivin-1基因上下游引物，以A549细胞系抽提的R．NA为模板进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR），扩增产物用BarnHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．0中，用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA30-SVV-1和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pcDNA3.0—SVV-1导入肺腺癌细胞系A549中，嘌呤霉素选择培养，经免疫组化法和western blot鉴定其表达。结果RT—PCR扩增出长448bp的特异性片段，经克隆至pcDNA3．0后酶切鉴定证实，并测序表明序列与Gen—Bank报道完全一致。pcDNA3．0—SVV-1在A549细胞中有稳定表达。结论成功克隆了SVV-1的编码序列，构建了其真核细胞表达载体pcDNA3．0-SVV-1，有助于对SVV-1基因在腺癌发生中的致瘤机制做进一步研究。     

昆明山海棠总生物碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡与细胞周期改变

目的 为探讨昆明山海棠总生物碱(alkaloidsfrom Tripterygium Hypoglaucum Hutch,THHa)抗肺癌机制,研究THHa诱导肺腺癌A549细胞凋亡与细胞周期改变的关系.方法 应用形态学观察、DNA凝胶电泳、流式细胞仪检测分析肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期改变.结果 THHa能够诱导肺腺癌A549细胞凋亡并主要作用于细胞周期S期(S期细胞增多).结论 THHa可能通过诱导细胞凋亡而抑制A549细胞增殖,这种作用与细胞周期有关,这些有助于将来肺癌治疗方案的合理设计.     

榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株细胞周期及凋亡的影响

目的:探讨榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株细胞周期及凋亡的作用。方法:体外培养人肺腺癌A549细胞株,四甲基偶氮唑蓝比色法测定不同浓度榄香烯乳在不同作用时间下对A549细胞株的生长抑制作用。用流式细胞术检测榄香烯乳作用24h后A549细胞株的周期及凋亡变化。结果:榄香烯乳作用后人肺腺癌A549细胞株增殖明显受抑制,呈时间和剂量依赖性。作用24h后G2/M期比例明显升高,S期细胞比例显著下降,凋亡率增加。结论:榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株有明显的增殖抑制作用,可引起A549细胞G2/M期阻滞及诱导其凋亡。     

RNA沉默HMGN5基因对肺癌A549细胞增殖的影响及意义

目的 通过RNA干扰技术(RNAi)沉默HMGN5基因,探讨其对肺癌A549细胞增殖的影响.方法 培养人肺癌A549细胞株,HMGN5基因合成慢病毒载体感染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测A549细胞中HMGN5沉默率;设阴性对照组及RNA干扰组,MTT法检测A549细胞的增殖能力;Brdu法检测沉默HMGN5的表达;流式细胞仪检测其细胞周期.结果 与对照组比较,RNA干扰组HMGN5基因的mRNA及蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);A549细胞的增殖能力明显下降,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖率为29.70％,较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05);G1期细胞为53.50±0.30,高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用RNAi能够沉默HMGN5基因,人肺癌A549细胞增殖能力显著降低,HMGN5基因可能参与肺癌的发生、发展、增殖过程.     

5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对人肺腺癌A549细胞株的生长抑制作用

目的：探讨5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-dC）对人肺腺癌A549细胞株的抑制作用及其机制。方法：采用四甲基偶氮噻唑氮蓝（MTT）法测定5-Aza-dC对A549细胞生长的影响;考马斯亮蓝G-250染色法测定5-Aza-dC作用后A549细胞蛋白质含量;Hoechst 33258荧光染色检测A549细胞凋亡和形态改变。结果：40～100μg/mL 5-Aza-dC对A549细胞的增殖有明显抑制作用,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）,并具有明显的时效和量效关系,同时蛋白质相对含量下降。60～100μg/mL 5-Aza-dC作用后A549细胞出现明显形态改变且凋亡增加。结论：5-Aza-dC对人肺腺癌A549细胞的生长具有抑制作用,并引起蛋白质相对含量明显下降和细胞凋亡,其机制可能与阻滞细胞周期,蛋白质功能改变及诱导细胞凋亡有关。