实时荧光定量聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种快速、准确、特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法. 方法 以金黄色葡萄球菌FemB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测. 结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度为1.0×103拷贝,能特异区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌. 结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌准确快速定量检测.     

食品中金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测法

目的建立一种简单、快速、准确、特异性强的能定量检测金黄色葡萄球菌的方法。方法以金黄色葡萄球菌FomB基因为靶序列，设计并合成引物和Taqman探针，优化引物与探针比例，调整镁离子浓度，对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测。结果引物与Taqman探针比例为1：4，镁离子为2．5mmol／L时本底最低，荧光信号最强；该法的灵敏度1．0×10^3拷贝，能特异区分金色葡萄球菌与其他葡萄球菌。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌进行准确快速及定量检测。     

TaqMan探针法荧光定量PCR检测食品中金黄色葡萄球菌

目的:建立食品中金黄色葡萄球菌快速、简便、准确、高效的检测方法。方法:以金黄色葡萄球菌FemB基因中保守序列为目标,设计并合成引物和Taqman探针,构建重组质粒作为标准阳性模板,建立荧光定量检测体系,并考察该方法的灵敏性、特异性和重复性。结果:该法的灵敏度60拷贝/反应体系,能特异区分金黄色葡萄球菌与其它类型的细菌,同时,具有良好的重复性。结论:使用Taqman探针法荧光定量PCR技术能够对金黄色葡萄球菌进行快速准确地定量检测。     

实时荧光定量PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立与应用评价

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法以MRSA mecA基因为靶序列设计引物和探针,以自MRSA中提取的DNA为模板,优化引物、探针的浓度和退火温度,同时验证方法的特异性、敏感性、重复性、灵敏度和线性范围,并与K-B法和微量琼脂稀释法(MIC)相比较。结果建立的反应体系在上游引物、下游引物浓度为0.2 mmol/L、退火温度为55℃时,具有良好的特异性和敏感性,与大肠埃希菌等8种细菌均无交叉反应;对MRSA检测的灵敏度达到10 CFU/ml。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对MRSA做出快速准确的报告,实现准确、快速和定量检测。     

脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法建立及评估

目的 建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法,为快速、准确检测脑膜炎奈瑟菌提供有效的手段.方法 选用脑膜炎奈瑟菌夹膜转运基因ctrA作为靶基因,设计合成引物和探针,建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法.并对该方法的特异性、敏感性、可重复性等进行方法学评价.结果 采用该方法对流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺...     

PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用分析

目的分析PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用,发掘PCR技术的价值和作用。方法采用Taqman探针实时荧光定量PCR技术,针对沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因设计引物和Taqman探针,快速检测沙门氏菌。结果检测沙门氏菌时,PCR技术与传统的检测技术相比,不仅快速,而且准确,具有较高的实用的价值。结论采用PCR技术,有利于实现快速检测沙门氏菌。     

荧光定量PCR技术在食源性疾病病原菌快速检测上的应用与评估

目的:应用荧光定量PCR技术,实现对食源性疾病病原菌的快速检测。方法:选取食源性疾病常见的四种病原菌,沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,根据它们的基因保守区设计特异性引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR技术,同时验证方法的敏感性和特异性,并与普通PCR、常规培养法进行比较。结果:用荧光定量PCR技术检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的检测灵敏度可达4 CFU/ml～8 CFU/ml,其敏感性比普通PCR高10倍,比常规培养法高1000倍。且快速简便,特异性强,从核酸提取至完成检测最快能在2 h～3 h内完成,而常规培养需3 d～4 d。通过对282件样品的检测,证实该方法可以使阳性检出率从常规法的8.51%提高至14.18%。结论:建立的荧光定量PCR技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于食源性疾病病原菌的快速检测。     

实时荧光聚合酶链反应检测粪便标本中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的:建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法:选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果:采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌femB基因72例(14.8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15.3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12.5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1.4%,1/72)。结论:应用Taqm an探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查。     

金黄色葡萄球菌coa基因实时荧光PCR的建立及应用研究

目的建立金黄色葡萄球菌coa基因Taq Man-MGB探针实时荧光PCR,并在食品安全风险监测中应用。方法根据金黄色葡萄球菌coa基因序列设计引物与Taq Man-MGB探针,建立并优化实时荧光PCR反应体系,并在食品安全风险监测中应用,同步进行传统细菌分离,比较2种检测方法的符合性。结果建立金黄色葡萄球菌coa基因Taq Man-MGB探针实时荧光PCR仅需42 min可完成检测,与表皮葡萄球菌、链球菌等非目标细菌无交叉反应,对重组质粒的灵敏度达5 copy/μl;对200份食品安全风险监测标本进行快速筛查,检测出15份阳性,传统方法也从相应样本中分离出15株金黄色葡萄球菌。结论针对金黄色葡萄球菌coa基因建立的Taq Man-MGB探针实时荧光PCR,可提高食品检测速度和灵敏度。     

金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法的建立

目的建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法,用于对金黄色葡萄球菌计数。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列(GenBank:DQ399678.1),设计并合成引物和荧光标记探针,建立和优化反应体系,用已知浓度的金黄色葡萄球菌DNA模板作为外部参照,建立标准曲线。用加入金黄色葡萄球菌的模拟牛奶样品,把Baird-Parker平板计数结果和PCR定量检测结果进行比较,以评价体系性能。结果平板计数和荧光定量PCR的检测结果做比较,采用配对t检验,t=0.58,v=32,P0.05,其结果差异无统计学意义。结论所建立的金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法,操作较传统的方法简单直接,能有效地缩短整个检测的时限,并有较好的灵敏度和特异性,与传统方法相比,有较明显的优势。     

荧光实时定量PCR检测溶藻弧菌方法的建立

目的 建立荧光实时定量PCR(qPCR)定量检测溶藻弧菌的方法,检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法 选择溶藻弧菌的鞭毛基因fliC为目的基因设计探针引物,建立Taqman探针qPCR体系。采用双盲法设计,分别用qPCR和Biolog Microstation System对溶藻弧菌和10株相关细菌进行鉴定,以考核qPCR检测体系的特异性。同时,通过梯度稀释和绘制标准曲线,评价利用qPCR检测溶藻弧菌的灵敏度。结果 本试验建立的qPCR方法能特异、准确、快速鉴定溶藻弧菌,敏感度达102CFU/ml。结论 qPCR方法能够有效快速检测溶藻弧菌。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

实时定量PCR检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA方法的建立

目的建立实时定量PCR（RQ—PCR）快速检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA的方法,以便早期定量评估肠屏障损伤所致肠道内细菌移位引起或加重的全身感染。方法对15份模拟全血标本及26份外科发热患者全血标本进行RQ—PCR检测。选择金黄色葡萄球菌高度保守的看家基因femA基因作为靶基因设计引物和Taqman探针,建立20ul的RQ—PCR反应体系,采用含靶基因扩增片段的重组质粒建立标准曲线,提取血标本中的细菌基因组DNA。结果引物和探针特异性好,检测限为10^0拷贝／ul（10^3CFU／ml）,灵敏度为99．7％,特异度为94．6％。标准曲线线性关系好,R。在0．9918—0．9997。不同浓度的金黄色葡萄球菌样本检测的平均准确性为（96．25±2．26）％,批内及批间重复性的平均变异系数分别为（8．06±0．07）％和（10．01±4．40）％。全血标本中金黄色葡萄球菌DNA平均回收率为（111．72±20．72）％。临床血标本RQ-PCR检测阳性率为15．4％（4／26）,血培养结果皆为金黄色葡萄球菌阴性。结论RQ—PCR可用于定量检测全血标本中的金黄色葡萄球菌DNA含量,具有快速、灵敏、特异性强、重复性好的优点。     

PMA-实时荧光PCR快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌

目的 将叠氮溴化丙锭（PMA）与实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术相结合,快速检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。方法 通过对影响PMA作用的关键因素,包括PMA浓度、光照时间以及活、死菌比例混合等进行试验,确定PMA的作用条件。以金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,建立PMA-实时荧光定量PCR方法,并构建金黄色葡萄球菌重组质粒标准品,用于检测蔬果中金黄色葡萄球菌活菌。结果 在PMA 30 μg/ml浓度下,曝光5 min,可实现PMA筛选金黄色葡萄球菌活菌的作用。由构建的质粒标准品模板建立标准曲线表现出良好线性关系,相关系数r = 0.9995,所建立的方法灵敏度可达到14 copies /μl,且特异性良好。经2 h增菌后用PMA进行筛选,再用荧光定量PCR检测,可实现快速对蔬果样品中活的金黄色葡萄球菌的检测。结论 用PMA-实时荧光定量PCR方法可快速检测蔬果中活的金黄色葡萄球菌,可为食品安全风险监测提供可靠数据。     

污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacilli)是近年新发现的条件致病菌,临床上曾引起爆发性脓毒血症,本文拟建立污蝇杆菌荧光定量PCR的快速检测方法。方法 根据污蝇杆菌W.chitiniclastica SH04的全基因组DNA序列,采用Primer Express 3.0设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光定量PCR的快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果 污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法具有良好的特异性,重复性试验的变异系数均<2%,灵敏度为19 CFU/反应(20μL反应体系),使用该方法检测6份人为污染的样品,结果均为阳性,6份阴性对照及空白对照均为阴性。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测污蝇杆菌。     

荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

目的 建立Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法.方法 针对肺炎链球菌自溶素基因设计引物及探针,建立荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链球菌感染.采用肺炎链球菌标准株,构建质粒,用质粒构建标准品,扩增标准品,绘制标准曲线并检验新建荧光定量PCR的敏感性,采用本实验冻存其他菌DNA样本,检测其特异性;采集2015年9月至2015年12月份北京地区家5家医院儿童门诊或病房,诊断为呼吸道感染患儿的咽拭子标本133例,对新建荧光定量PCR法进行临床样本的验证.结果 绘制了荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链菌感染的标准曲线;新建荧光定量PCR可检测的肺炎链球菌最低拷贝数为10copies/μL;新建荧光定量PCR可成功区分几种病原体DNA,具有较好特异性;采用新建荧光定量PCR检测临床样本132例,其中肺炎链球菌阳性25例,阳性率为18.94%.结论 新建立的荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床样本的检验.     

实时荧光定量PCR技术及在植入前遗传学诊断中应用

实时荧光定量聚合酶链反应技术是一种基于荧光共振能量转移原理进行核酸定量的新型技术,常用荧光检测系统主要包括SYBR Green Ⅰ染料、Taqman探针、分子信标探针、蝎子引物探针、杂交探针、LUXTM引物、Amplisensor探针等.目前该技术已成功应用于胚胎植入前遗传学诊断的性别鉴定、基因型分析、基因突变检测和基因表达研究等方面,具有潜在的应用价值.     

实时荧光定量PCR技术及在植入前遗传学诊断中应用

实时荧光定量聚合酶链反应技术是一种基于荧光共振能量转移原理进行核酸定量的新型技术，常用荧光检测系统主要包括SYBR GreenⅠ染料、Taqman探针、分子信标探针、蝎子引物探针、杂交探针、LUXTM引物、Amplisensor探针等。目前该技术已成功应用于胚胎植入前遗传学诊断的性别鉴定、基因型分析、基因突变检测和基因表达研究等方面，具有潜在的应用价值。     

交叉引物恒温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种快速、特异、灵敏的交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification,CPA)技术检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)耐热核酸酶基因(nuc)。方法从GenBank上下载多条金黄色葡萄球菌nuc基因序列,在其保守区域设计CPA引物及探针,建立CPA恒温扩增快速检测技术,并对反应条件进行优化,同时验证方法的特异性和敏感性。结果本方法对金黄色葡萄球菌检测具有高度特异性,对构建的阳性质粒DNA灵敏度达到1.0×10~1 copy/μl,对12份临床标本的检测阳性率与荧光PCR法相同,同时CPA法实验过程操作简便、反应迅速,且无需使用昂贵仪器,最快可在40 min内出检测结果。结论本研究建立的CPA法快速、简便、灵敏、特异,适用于金黄色葡萄球菌核酸快速检测。     

多重荧光PCR检测婴幼儿食品中常见病原菌

目的建立婴幼儿食品中3种常见病原菌的多重荧光PCR检测方法。方法根据阪崎杆菌16S-23SrDNA保守区、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列和蜡样芽胞杆菌cerA特异基因,设计合成引物和探针,优化反应条件。结果建立的多重荧光PCR方法只特异性地扩增目标病原菌;用国标法和多重荧光PCR方法同时对194份奶粉和米粉样品进行检测,结果完全一致。多重荧光PCR方法检测过程可在8h内完成。结论建立的多重荧光PCR法敏感性高、特异性强、快速、准确,可同时检测婴幼儿食品中的阪崎杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌,适合批量样本检测,有很好的应用前景。