重组结核分枝杆菌16000蛋白抗原(rPA16)豚鼠皮肤试验效果的研究

目的 :以豚鼠为动物模型 ,分析重组 16 0 0 0蛋白抗原rPA16能否引起迟发型超敏反应 (DTH)。方法 :连续 3次皮下注射结核分枝杆菌H37Rv热灭活菌体 ,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照 ,PPD为阳性对照组 ,重组蛋白则设置 0 .1,0 .2 ,0 .4μg三个剂量 ,分别进行背部皮内注射 ,注射后 2 4～ 72h观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果 :0 .1～ 0 .4μg/ 0 .2ml的重组蛋白抗原rPA16在 48～ 72h阳性反应平均直径与PPD相比均无显著差异 (均P >0 .1) ,3种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著差异 (P >0 .1)。 48h为rPA16引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论 :重组结核分枝杆菌 16 0 0 0蛋白抗原与PPD相比 ,所引起的豚鼠皮肤DTH的反应能力基本相似 ,具有皮肤试验的潜在应用价值     

重组结核分枝杆菌1600O蛋白抗原(rPA16)豚鼠皮肤试验效果的研究

目的以豚鼠为动物模型,分析重组16000蛋白抗原rPA16能否引起迟发型超敏反应(DTH)。方法连续3次皮下注射结核分枝杆菌H37Rv热灭活菌体,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照,PPD为阳性对照组,重组蛋白则设置0.1,0.2,0.4μg三个剂量,分别进行背部皮内注射,注射后24～72h观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果0.1～0.4/0.2ml的重组蛋白抗原rPA16在48～72h阳性反应平均直径与PPD相比均无显著差异(均P＞0.1),3种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著差异(P＞0.1)。48h为rPA16引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论重组结核分枝杆菌16000蛋白抗原与PPD相比,所引起的豚鼠皮肤DTH的反应能力基本相似,具有皮肤试验的潜在应用价值。     

重组结核分支杆菌16000蛋白抗原(rPA16)的免疫原性研究

目的：研究结核分枝杆菌重组16000蛋白（rPA16)诱发家兔产生抗体的能力并评价其血清学诊断的价值。方法：家兔按注射的抗原及佐剂的不同分组，皮下多点注射分别进行免疫，6次免疫后采血，双向琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）跟踪兔血清抗体效价的时间效应并检测兔血清与所试各类分支杆菌PPD有无交叉反应；同时检测rPA16与各分支杆菌PPD的免疫羊血清的反应，并用rPA16抗原检测人血标本，分析该抗原的临床检测的敏感性和特异性。结果：兔血清抗体效价结果显示：5个月后，加佐剂的抗原组的兔免疫血清仍能检测到抗体，不加佐剂组2个月后血清抗体检测即为阴性，ELISA检测兔免疫血清比双向琼脂扩散方法要更敏感，rPA16抗原加佐剂引起的兔血清抗体滴度最高可达1：6400，不加佐剂组的血清抗体滴度仅为1：400，ELISA法分析抗rPA16的兔血清的特异性表明其特异笥较好，仅与牛、人型结核分支杆菌的PPD呈阳性反应，与其他所试分支杆菌PPD反应均为阴性，同时又分析了rPA16抗原的特异性，与人型PPD相比，该抗原只与所试各类分支杆菌，BCG、牛分支杆菌免疫的血清呈阳性反应，而人型PPD则基本上与结核分支杆菌免疫的血清均呈阳性反应，ELISA检测血清标本结果：肺结核病组中rPA16和PPD检测敏感性分别为64.8%和75.2%；健康组，卡介苗接种阳转健康组，rPA16和PPD检测特异性分别为96.2%,88.5%和94.3%,66.7%。结论：rPA16具有较强的免疫原性和一定的特异性，可能成为结核病血清学诊断试剂之一。     

重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白皮肤试验与结核菌素皮肤试验的比较研究

目的比较重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白(重组11 kDa蛋白)皮肤试验与结核菌素皮肤试验(PPD)两种检测方法,探讨更适合结核分枝杆菌潜伏感染者的筛查方法。方法选取2015年9月北京市大兴区某大学新生共461名,进行重组11 kDa蛋白和PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 mL重组11 kDa蛋白(10μg/L)和0.1 mL结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)(50 U/mL),观察注射后72 h后皮肤反应。于皮肤试验前采集461名志愿者的静脉血,进行体外γ干扰素释放试验(T-SPOT.TB)检测,采用T-SPOT.TB试剂盒进行。比较重组11 kDa蛋白皮肤试验、结核菌素PPD皮肤试验的差异性。结果以注射72 h后的硬结反应进行统计,2种检测结果显示男女阳性率比较,差异无统计学意义。重组11 kDa蛋白皮肤试验中阳性反应者为17名,阳性率为3.68%;PPD皮肤试验中强阳性反应者为8名,强阳性率为1.74%。以T-SPOT检测结果为标准,重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为39.53%,100.00%,94.36%;PPD皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为16.28%,99.76%,91.97%。结论重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度高,与体外T-SPOT.TB检测结果一致且简便易行,有望成为结核分枝杆菌潜伏感染的新的筛查方法。     

结核分枝杆菌16KD蛋白的基因克隆及表达与纯化

目的:通过构建结核分枝杆菌(MTB)16KD蛋白的表达载体,在大肠杆菌(E.coli)中表达MTB16KD蛋白,并获得大量纯化的16KD蛋白。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出16KD蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后插入载体pGEX-4T-2中,测序结果证实后,将重组质粒转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达GST-16融合蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的相对分子质量及表达形式。Western blot鉴定16KD蛋白活性。经GST亲和层析柱过柱,得到纯化的16KD蛋白。结果:构建了具有正确基因序列的表达载体,在E.coli DH5α中诱导表达的融合蛋白GST-16占菌体总蛋白的42%。Wstern Blot结果证明:融合蛋白GST-16能与抗结核分枝杆菌的抗体发生特异性结合。紫外分光光度仪测量纯化16KD蛋白的浓度为688mg/L。结论:结核分枝杆菌16KD蛋白在E.coli DH5α能高效表达,该蛋白具有特异的免疫学活性。     

结核分枝杆菌重组MTB48蛋白抗原血清学诊断价值的研究

目的 研究重组MTB48(recombinant MTB48,rMTB48)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂.方法 应用基因工程技术表达、纯化rMTB48蛋白,通过酶联免疫吸附试验方法检测402例血清中抗结核抗体.结果 rMTB48蛋白在大肠杆菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,分子量约57.6 kD,具有良好的抗原特异性.在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗MTB48抗体的阳性率分别为41.7%和24.3%,总的灵敏度为32.9%.在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗MTB48抗体的阳性率分别为0.0%和11.3%,总的特异性为5.7%.结论 rMTB48蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一.     

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论 :从我们的实验结果来看重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH反应可以代替PPD     

硝酸盐还原酶试验检测结核分枝杆菌耐药性的研究

目的 探讨一种快速、廉价、方便的结核分枝杆菌耐药性分析方法，缩短结核分枝杆菌药敏试验时间。方法 采用硝酸盐还原酶试验(Nitrate Reductase Assay，NRA)与绝对浓度法对照，验证新方法的灵敏度和特异性。结果 两种试验方法可比性好，与绝对浓度法相比较，硝酸盐还原酶试验敏感性为91．7％，特异性为100．0％，NRA法比传统绝对浓度法平均缩短时间2～3周。结论 硝酸盐还原酶试验优于传统绝对浓度法。     

散发性皮肤非结核分枝杆菌感染37例回顾研究

目的：通过分析散发性皮肤非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）感染的临床及病理特点,探讨皮肤NTM感染诊断方法的准确性及药物治疗原则。方法：回顾分析北京大学人民医院皮肤科门诊自2000年1月至2014年3月诊治的散发性皮肤NTM感染患者,病原学检查方法主要包括细菌培养鉴定及PCR扩增病损组织DNA分枝杆菌hsp65基因并鉴定。结果：共37例患者,30例为海分枝杆菌感染,6例为脓肿分枝杆菌感染,1例为龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌感染,PCR法较细菌培养更为敏感;21例有外伤史,21例有养鱼史或海产相关工作史,1例有美容手术史。海分枝杆菌感染皮疹多表现为结节和浸润性斑块,沿淋巴管播散常见,脓肿分枝杆菌感染临床缺乏特异性,组织病理上常表现为感染性肉芽肿。海分枝杆菌感染患者多采用利福平、乙胺丁醇、克拉霉素二联或三联治疗,治愈率90.00%;6例脓肿分枝杆菌感染患者中4例治愈,1例死亡。结论：散发性皮肤NTM感染以海分枝杆菌感染最常见,外伤（包括美容或手术）及鱼类或海产接触为常见诱因;组织病理改变无致病菌特异性,确诊需有病原学诊断依据。海分枝杆菌感染的治疗可选用利福平、乙胺丁醇、克拉霉素中任两种联合治疗,脓肿分枝杆菌感染的治疗应依据药物敏感试验结果制定方案。     

结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究现状及展望

结核病的实验室诊断技术主要包括细菌学、免疫学和分子生物学等三大领域的诊断方法。与细菌学和分子生物学技术相比，免疫学诊断技术同时兼具简便、快速、价廉、无需贵重仪器、容易在基层实验室推广等优势，因此，长期以来一直是结核病研究人员重点关注并且坚持不懈努力的研究方向。     

结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

干扰素γ释放试验在诊断血液透析患者结核分枝杆菌感染中的价值

【摘要】 目的 对结核菌素皮肤试验与干扰素-γ释放试验检测血液透析患者结核分枝杆菌感染的方法进行比较,评价不同方法检测血液透析患者结核分枝杆菌感染的临床应用价值。方法 回顾性分析2015年9月~2016年9月200例在医院行血液透析的疑似结核感染患者,用结核菌素皮肤试验（TST）与干扰素-γ释放试验（IGRA）分别检测200例患者,分析比较两种方法诊断血液透析患者结核分枝杆菌感染的阳性率、敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率及与卡介苗接种和既往结核感染的相关性。结果 两种试验方法阳性检出患者年龄、血液透析时间、有卡介苗疤痕人数、性别等均无统计学差异（P＞005）;IGRA试验检测阳性率显著高于TST试验（P＜005）;IGRA检出阳性率与卡介苗接种史、结核病史均相关（P＜005）,TST检出阳性率与卡介苗接种史具有相关性（P＜005）,但与结核病史不相关（P＞005）。IGRA敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率均优于TST。结论 相较于结核菌素皮肤试验,干扰素-γ释放试验检测血液透析患者结核分枝杆菌感染检出阳性率、敏感性、特异性高,假阳性、假阴性率低,可在临床推广应用。     

结核分枝杆菌蛋白抗原T细胞表位的研究进展

结核分枝杆菌(Mtb)的蛋白抗原根据所处细胞位置的不同,可分为分泌性蛋白、胞质内蛋白和膜脂蛋白三类。其中Mtb分泌性蛋白对抗结核菌感染的免疫作用最为重要。     

结核分枝杆菌rCFP10—ESAT6融合蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的实验研究

目的探讨以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原用皮试法评价其对结核分枝杆菌（Mtb）和卡介苗（BCG）致敏豚鼠的鉴别意义。 方法分别用灭活H37Rv和BCG活菌致敏豚鼠．4wk后用不同剂量的rCFP10—ESAT6对同一只豚鼠作皮试，同时设立5IU结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）阳性对照及生理盐水（NS）阴性对照，于注射后24、48、72h测量红肿或硬结的直径。 结果以rCFP10-ESAT6为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为100．0％（21／21）、90．9％（10／11），以PPD为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为47．6％（10／21）、90．9％（10／11），以rCFP10-ESAT6为抗原的迟发型超敏反应（DTH）中，以1．0μg剂量效果最好．观察时间以皮试后24h效果最好，1．0μg重组融合蛋白在Mtb致敏豚鼠上引发的红肿、硬结比5IU PPD引发的红肿、硬结大。 结论rCFP10-ESAT6能诱导Mtb致敏豚鼠发生DTH，能特异区分Mtb致敏豚鼠及BCG免疫豚鼠，抗原剂量及反应时间是rCFP10—ESAT6诱导豚鼠DTH的主要影响因素。     

中草药抗结核分枝杆菌的实验研究

目的:在实验条件下观测部分中草药在单味和复方组合下,对结核分枝菌的抗菌活性.方法:采用琼脂绝对浓度法,加入不同浓度的单味或复方中草药,接种结核分枝杆菌(HV37株),在37℃下培养一个月.结果:大蒜液1:10;百部液1:5;夏枯草液1:5有抑制结核茵生长作用;而大蒜百部混合液1:20;夏枯草大蒜混合液1:20;夏枯草百部混合液1:10;大蒜夏枯草百部混合液1:40均有抑制结核分枝杆菌生长的作用.结论:三种中草药在实验条件下均有抗结核分枝茵的作用,联合药效比单药的作用强.     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

目的克隆肝素结合血凝素（HBHA）基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果克隆了HBHA基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法得到28 kD纯化蛋白,与文献报道相符。     

10种抗结核药物对结核分枝杆菌的体外抑菌试验结果分析

目的 :探讨结核分枝杆菌 (Mycobacterium Tuberculosis MTB)对抗结核药物的体外耐药情况。方法 :采用绝对浓度法对 840株结核杆菌和 2 69株多耐药结核杆菌 (Multidrug- resistant- Tuberculosis MDR- TB)进行 10种抗结核药物体外抑菌试验。结果 :在 840株 MTB中 10种药物耐药率最高的为 RFP(43 .8% ) ,最低为 CPM(4.6% ) ,而 2 69株MDR- TB的耐药率最高为 SM(74.6% ) ,最低为 CPM(11.9% )。结论 :应加强抗结核药物的耐药性监测 ,根据药敏试验选择科学有效的化疗方案     

非结核分枝杆菌快速药敏试验研究

目的研究结核分枝杆菌BACTEC MGIT 960系统液体培养法和美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSIM)24-A微量肉汤稀释法的快速药敏试验与对非结核分枝杆菌的意义。方法分别采用BACTEC MGIT 960液体培养法联合微量肉汤稀释法的快速药敏试验与L-J固体培养法和绝对浓度药敏法分别对48份非结核分支杆菌(nontubeerculous mycobacteria,NTM)培养时间和药敏报告时间进行比较研究。结果 48份NTM在BACTEC MGIT 960培养仪的平均阳性报告时间(7.0±1.1)d,L-J培养基平均阳性报告时间(17.6±3.9)d,两者比较差异有统计学意义(t=-18,P0.01);微量肉汤稀释法结果报告时间为(7.2±1.2)d,L-J固体药敏试验报告时间为(27.3±2.4)d,两者比较差异有统计学意义(t=-52.2,P0.01),两种药敏试验方法对相同种类药物的耐药率均为90%以上,微量肉汤稀释法比L-J法可以检测的药物种类更多。结论 BACTEC MGIT 960液体培养法联合微量肉汤稀释法的快速药敏试验比L-J固体培养法和绝对浓度药敏法在培养时间和药敏结果种类及报告时间上有着明显优势。     

结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验对淋巴结结核的诊断价值

目的 探讨结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)对淋巴结结核的诊断价值。方法 将2012年7月至2015年10月安徽省胸科医院收治的134例淋巴结肿大患者分为结核组(95例)和非结核组(39例),另取健康对照组28例,采外周血行T-SPOT.TB检测,对比分析3组T-SPOT.TB的阳性率,敏感度及特异度。结果 结核组、非结核组和健康对照组T-SPOT.TB阳性率分别为85.26%、15.38%和3.57%,结核组患者T-SPOT.TB阳性检测率显著高于其他两组。T-SPOT.TB诊断淋巴结结核的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为85.26%、89.55%、92.05%和81.08%。结论 T-SPOT.TB试验可作为淋巴结结核的重要诊断手段。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础