建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术

目的建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的"凸背"引物荧光PCR新技术。方法对比"凸背"引物荧光PCR新技术和Sanger测序法:通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D(GGT>GAT)质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病(AML)患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率。结果 "凸背"引物荧光PCR新技术能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,高于Sanger测序法的10%~20%。在97例AML患者的外周血的DNA中,"凸背"引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7%。结论 "凸背"引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现。     

实时荧光PCR检测HBV DNA与ELISA检测HBV M结果分析

目的探讨荧光PCR检测HBV与ELISA检测HBV M结果之间的关系。方法采用实时荧光PCR法和ELISA法,对323例HBV感染者进行HBV DNA和HBV M检测。结果 HBsAg、HBeAg、HBcAb或HBsAg、HBeAg阳性者,其HBV DNA阳性率及病毒含量高于其它组,且有显著性差异。结论实时荧光PCR法和HBV M检测法各有其不同的临床意义,二者不可替代,互相具有参照作用。     

乙型肝炎病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立与评价

目的应用Taq-man实时荧光PCR技术,建立一种超敏检测乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)载量的方法(以下简称超敏试剂),并对其临床应用进行评价。方法对比GeneBank中HBV DNA基因组序列,使用Primer 5.0软件在其S区和C区分别设计一对特异性的引物和探针,应用Taq-man探针技术,优化反应体系和反应条件。并收集195例临床样本与某国产试剂进行平行检测,采用相关性分析和Bland-Altman等方法对检测结果进行分析。结果建立的HBV DNA超敏检测方法灵敏度达10 IU/mL,线性范围20～1×10~9IU/mL,准确性为100%,覆盖型别为A、B、C、D、E、F、H,批内和批间变异系数在5%以内。195例临床样本检测结果显示,与某国产试剂相比,超敏试剂的阳性符合率为99.45%,阴性符合率为91.67%,总符合率为98.97%(Kappa值为0.911 2,P<0.05)。超敏试剂与某国产试剂具有很强的相关性(r=0.979 1,P<0.000 1)。结论本研究成功建立了一种HBV DNA实时荧光PCR检测方法,具有很高的临床应用价值。     

实时荧光PCR用于流感病毒检测的效果分析

目的探讨和研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应在流感病毒检测中的应用效果。方法采用实时荧光PCR对617例流感样病例患者的咽拭子标本进行流感病毒核酸的测定,对检测出的阳性标本采用MDCK进行培养并分离,对两种方法的检测结果进行分析,对比特异性及灵敏度。结果本组617例标本中实时荧光PCR共检测出阳性标本152例,阳性率24.6%;细胞培养法在此152例阳性标本中共分离出流感病毒79例,阳性率12.8%,实时荧光PCR检测阳性率显著高于细胞培养法,差异具有统计学意义(P0.05)。结论实时荧光PCR能够快速有效的检测出流感病毒核酸,是实验室快速诊断的有效手段。     

河弧菌Taqman实时荧光PCR检测方法建立

目的 建立以Taqman实时PCR检测河弧菌的方法。方法 根据河弧菌toxR基因的保守序列设计引物和Taqman探针,建立检测河弧菌的实时PCR方法;对引物和探针的浓度进行优化,对优化后建立的方法分别进行实验室内的灵敏度和特异性评价,并与常规PCR比较。结果 建立了检测河弧菌的实时PCR方法,经优化该方法选择引物的浓度为100 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L;该方法对纯菌的检测下限为4.17×10²cfu/mL,比常规PCR高1000倍;针对toxR基因建立的河弧菌实时PCR方法,对8种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论 建立的方法能够特异和敏感地检测河弧菌,可用于河弧菌的快速筛检。     

国境口岸猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立

〔目的〕建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。〔方法〕制备猴痘病毒阳性样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。〔结果〕本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸。〔结论〕本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障我国的国境口岸卫生安全具有重要意义。     

荧光定量PCR检测HBV DNA

目的：探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBV M)表现模式的关系。方法：对1207例慢性乙型肝炎患者进行血清HBV DNA荧光定量PCR分析，HBV M检测采用ELISA法。结果：血清HBV DNA水平与HBV M表现模式有关，HBsAg与HBeAg的存在影响HBV DNA水平变化。结论：HBbAg和HBV DNA有明显的相关，抗—HBe、抗HBc阳性者病毒末完全停止复制，只是复制水平降低。     

下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价

目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本(包含不同基因突变型别)、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例(74/229,32.31%)YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例(44/229,19.21%)rtM204V突变,25例(25/229,10.92%)rtM204I突变,5例(5/229,2.18%)rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例(47/229,20.52%)rtM204V突变、25例(25/229,10.92%)rtM204I突变和2例(2/229,0.87%)rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%(71/74),部分符合率为4.05%(3/74)。2种方法的一致性(κ)为0.97(P<0.01)。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。     

实时荧光PCR法检测b型流感嗜血杆菌

目的利用荧光定量PCR技术,建立b型流感嗜血杆菌的快速敏感特异的检测方法。方法以b型流感嗜血杆菌荚膜基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以b型流感嗜血杆菌菌株,提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和退火温度。以b型流感嗜血杆菌和8种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为800 nM、200 nM,退火温度为56℃时,具有良好的特异性和敏感性。在8株相关菌株的检测中,除b型流感嗜血杆菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限100 cfu/mL。稳定性分析表明:同一样品重复检测4次C t值的最大变异系数为5.46%。与常规方法比较,符合率达100%。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快速,具有较大的推广及应用价值。     

食品过敏原荞麦的实时荧光PCR检测

目的:荞麦是日本法规要求强制性标识的食品过敏原,我国需要建立出口日本食品中过敏原荞麦成分的标准方法。方法:参考现有文献,采用实时PCR方法建立食品过敏原荞麦成分的检测方法。结果:研究表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为1 mg/kg。结论:本方法适用于食品中过敏原荞麦成分检测。     

非洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立

目的 建立非洲型寨卡病毒（ZIKV）实时荧光定量PCR检测技术。方法 人工合成非洲型ZIKV E基因上引物为5’ - TCAAAGATGATGTTGGAGCT - 3’、下游引物5’ - CCTCTCACAGTGGCYTCA - 3’、探针5’FAM - CCACCATTTGGGGATTCTTACATTGTC - BQ1 - 3’,采用实时荧光定量PCR检测其特异性、灵敏度及重复性。结果 非洲型ZIKV质粒标准品浓度为76.61 ng/μl;以非洲型ZIKV质粒标准品制作标准曲线,在2.47×（108～102） copies/μl之间有较好线性关系,Rsq为1;能特异检测出非洲型ZIKV质粒标准品,与登革病毒1～4、亚洲型ZIKV质粒标准品、HCV - 1b病人血清RNA无交叉反应,检测限为2.47×101copies/μl。结论 本研究建立了可用于非洲型ZIKV实验室检测的实时荧光定量PCR技术。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用

目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。     

实时荧光环介导等温扩增检测毛癣菌属方法的建立

目的建立实时荧光环介导等温扩增（Real-time Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）技术检测皮肤癣的方法,实现皮肤癣菌病的快速实验室诊断。 方法通过在NCBI官网查找下载皮肤癣菌中毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属临床分离率较高的菌种rRNA序列（18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2和28S rRNA）,运用DNASTAR Lasergene软件进行分析比对,寻找出毛癣菌属内高度保守的靶序列,且该段靶序列要与其他属存在差异,运用Primer Explorer V5设计LAMP引物。提取须癣毛癣菌NBRC6202基因组DNA作为模板筛选引物以及建立LAMP检测毛癣菌属的反应体系,以红色毛癣菌ATCC28188基因组DNA作为模板测试其敏感性和稳定性,以毛癣菌属以外的其他真菌、细菌基因组DNA验证LAMP反应体系的特异性。 结果筛选的4套引物里,primer2的扩增效果较好,可在22 min检测出须癣毛癣菌,且可以特异地检测出红色毛癣菌、指间毛癣菌、疣状毛癣菌、许兰毛癣菌、紫色毛癣菌。本研究建立的毛癣菌属RT-LAMP检测方法的最低检测限为1 pg/μL;在10 000 pg/μL、100 pg/μL和1 pg/μL三个浓度的分别10次重复检测实验中平均CT值和CV%分别为9.24±0.30,3.29%、10.57±0.54,5.12%、15.95±0.52,3.24%。 结论实验建立的毛癣菌属LAMP检测方法在特异性、敏感性和稳定性三方面均表现出优越的性能,能快速准确地检测出毛癣菌属常见菌种,具有良好的临床应用前景。     

鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pla基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的ca f1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,最终建立三色荧光定量PCR检测方法。结果本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,最低检出限为1×102copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好。结论建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、ca f1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

肠出血性大肠埃希菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异、有效的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重实时荧光PCR检测方法。方法根据GenBank公布的EHEC的stx1和stx2基因序列设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针分别用FAM-BHQ1和HEX-BHQ1标记stx1及stx2,建立双重实时荧光PCR反应体系,并对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。结果显示该方法特异性、重复性好、灵敏度高,最低检出限可达102cfu/ml,117.5fg/μl。结论建立的双重实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

HBV基因变异对荧光定量PCR系统检测HBV-DNA准确性的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型和病毒变异对Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48系统和荧光定量PCR系统检测HBV-DNA的影响。方法收集医院肝病中心2014年3月-2015年10月HBV感染患者100例,明确HBV基因型和变异情况,同时采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48系统和荧光定量PCR系统检测HBV-DNA,比较针对不同HBV基因型和病毒变异时两种方法检测结果的差异和相关性。结果两种方法检测B型、C型患者的病毒载量差异均无统计学意义,对未发生病毒变异的患者,两种方法的检测结果差异无统计学意义;对发生病毒变异的患者,两种方法的检测结果差异有统计学意义(t=2.29,P=0.028);两种方法检测B、C型HBV-DNA时的相关系数r分别为0.82、0.86,差异无统计学意义;两种方法检测未发生病毒变异患者HBV-DNA的相关系数r为0.91,显著高于发生病毒变异时的相关系数(r=0.70)(Z=3.13,P<0.01)。结论对于不同的HBV基因型,Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统和国产荧光定量PCR系统在检测HBV-DNA方面有较好的相关性,但HBV基因变异可能会影响后者的准确性。