生长抑制和DNA损伤诱导基因45β在足细胞损伤中的作用及机制

目的:研究生长抑制和DNA损伤诱导基因45β(GADD45B)在足细胞损伤中的作用及机制。方法:微分离37例肾活检证实的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者肾小球,qRT-PCR检测肾小球GADD45B基因表达,同时进行免疫组化检测GADD45B蛋白表达。进一步利用模式动物斑马鱼研究GADD45B基因功能,Podocin启动子驱动和UAS/GAL4系统构建足细胞上特异性表达GADD45B转基因斑马鱼,硝基还原酶/甲硝唑(NTR/MTZ)系统特异性诱导足细胞损伤,观察斑马鱼水肿发生率,定量检测蛋白尿及足细胞凋亡。结果:FSGS患者肾小球GADD45B基因和蛋白表达水平显著高于正常对照组,并与FSGS患者白尿、血白蛋白及血肌酐水平密切相关;斑马鱼研究结果显示,足细胞上高表达GADD45B能够显著加重MTZ诱导的足细胞损伤,GADD45Ba/b转基因鱼的水肿发生率和蛋白尿水平均显著高于野生型斑马鱼。活性caspase染色结果显示,GADD45B转基因鱼发生凋亡的足细胞数显著高于非转基因鱼。吗啉环寡聚核苷酸注射斑马鱼抑制GADD45B基因表达,则MTZ诱导的斑马鱼水肿发生率和蛋白尿水平显著降低。结论:高表达GADD45B显著加重足细胞受损,而抑制GADD45表达则能有效改善足细胞损伤,提示其可作为治疗足细胞损伤药物靶点。     

利用3D打印高通量观察斑马鱼肾小球滤过膜损伤

目的:使用桌面3D打印机制备兼容微孔板和平皿的斑马鱼定向工具,用于观察分析斑马鱼足细胞损伤后表型。方法:构建足细胞特异性表达硝基还原酶(NTR)的转基因斑马鱼Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mCherry),NTR/MTZ(甲硝唑)系统特异性诱导足细胞损伤,破坏肾小球滤过膜;应用Open SCAD软件设计模具的3D模型,打印材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯;结合3D模具和全自动体式显微镜对足细胞特异性损伤斑马鱼进行高通量筛查,对水肿比例和严重程度,蛋白尿程度进行定量分析。结果:桌面3D打印机制备的模具在微孔板或平皿内的琼脂凝胶中形成腔室,可排列48或96个斑马鱼胚胎样本。狭长的微腔确保斑马鱼胚胎方向和体位一致且不易移动。全自动显微镜获取排列在微腔内斑马鱼胚胎的侧面和背面视图,易于观察分析斑马鱼形态、荧光分布和强度。结论:本研究应用3D打印机制备模具,高通量定位观察斑马鱼水肿率和蛋白尿表型,是斑马鱼肾脏功能研究的有效工具。     

抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定

目的 研制抗弓形虫水通道蛋白(TgAQP)的特异性多肽抗体,并应用于检测弓形虫ME49株中水通道蛋白的表达和亚细胞定位。方法 根据TgAQP氨基酸序列设计B细胞抗原多肽,并将合成的多肽与KLH偶联作为免疫原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA、Western blot和免疫荧光的方法对所得抗体进行鉴定。结果 选定并合成抗原表位多肽,与KLH偶联作为免疫原制备多克隆抗体;经ELISA测定其多肽抗体效价达1∶40 000; Western blot表明制备的抗体能特异地识别天然弓形虫中29.9 kDa处的条带,与预测的TgAQP相对分子量大小相符;免疫荧光检测到抗血清识别的蛋白定位于弓形虫胞质中。结论 制备了抗弓形虫水通道蛋白多肽的多克隆抗体,为进一步研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点奠定了基础。     

基于硝基还原酶/甲硝唑系统构建斑马鱼急性肾损伤模型

目的:建立斑马鱼急性肾损伤模型,用于急性肾损伤相关分子机制、肾脏再生和药物筛选等研究。方法:(1)基于硝基还原酶/甲硝唑(NTR/MTZ,Nitroreductase/Metronidazole)系统,分别构建转基因斑马鱼Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry);(2)利用MTZ诱导双转基因斑马鱼幼鱼Tg(enpep:Gal4;UAS:NTRmCherry)肾小管上皮细胞损伤,分别观察幼鱼水肿率,肾小管红色荧光强度,通过原位杂交检测近端小管分子标志物slc20a1a表达水平,经心脏显微注射10KD FITC-Dextran检测近端小管重吸收功能,扫描透射电镜检测近端小管超微结构。结果:(1)转基因鱼Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)构建成功,可在双转基因斑马鱼幼鱼Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)受精后30h观察到肾小管中特异性表达红色荧光mCherry,呈现连续性分布于肾小管;(2)随着MTZ处理剂量的提高,胚胎心包水肿和身体水肿率逐步上升;(3)原位杂交结果显示近端小管分子标志物slc20a1a表达减弱甚至消失,近端小管重吸收功能下降甚至丧失,肾小管超微结构显示肾小管上皮细胞正常形态破坏,刷状缘脱落,管腔中可见微管结构。结论:基于NTR/MTZ系统的斑马鱼急性肾损伤模型构建成功,可用于急性肾损伤相关分子机制、肾脏再生和药物筛选等研究。     

Nephrin,podocin及α-actinin在小鼠肾小球足细胞系的表达与分布

目的 :探讨nephrin ,podocin及α actinin在小鼠肾小球足细胞系 (MPC5)的表达与分布 ,为进一步研究上述分子间的相互作用建立稳定的实验平台。　 方法 :培养小鼠MPC5,以γ 干扰素诱导在 33℃传代增生 ,继而在37℃培养两周使细胞分化成熟以用于实验研究。相差显微镜观察足细胞形态 ;免疫荧光染色观察nephrin ,podocin ,α actinin及WT1在足细胞的分布 ;RT PCR检测足细胞nephrin ,podocin及α actinin 4的mRNA ;免疫蛋白印迹检测nephrin ,podocin ,α actinin及WT1蛋白。　 结果 :成熟足细胞呈星形且有突起形成。免疫荧光及免疫蛋白印迹显示足细胞特异性的表达WT1分子。免疫荧光染色可见nephrin和podocin在足细胞内均呈线状分布于胞膜表面 ,α actinin呈细丝状分布于胞质内及伸出的突起中。在mRNA水平及蛋白水平均检测到nephrin ,podocin和α actinin 4表达 ,其蛋白大小分别为 180KDa,4 5KDa和 10 0KDa。　 结论 :首次在mRNA水平及蛋白水平证实了小鼠MPC5能够表达nephrin ,podocin及α actinin ,为进一步研究这些分子间的相互作用奠定了基础。     

Nephrin，podocin及α-actinin在小鼠肾小足细胞系的表达与分布

目的：探讨nephrin，podocin及α-actinin在小鼠肾小球足细胞系(MPC5)的表达与分布，为进一步研究上述分子间的相互作用建立稳定的实验平台。方法：培养小鼠MPC5，以γ-干扰素诱导在33℃传代增生，继而在37℃培养两周使细胞分化成熟以用于实验研究。相差显微镜观察足细胞形态；免疫荧光染色观察nephrin，podocin，α-actinin及WTl在足细胞的分布；RT-PCR检测足细胞nephrin，podocin及α-actinin4的mRNA；免疫蛋白印迹检测nephrin，podocin，α-actinin及WTl蛋白。结果：成熟足细胞呈星形且有突起形成。免疫荧光及免疫蛋白印迹显示足细胞特异性的表达WTl分子。免疫荧光染色可见nephrin和podocin在足细胞内均呈线状分布于胞膜表面，α-actinin呈细丝状分布于胞质内及伸出的突起中。在mRNA水平及蛋白水平均检测到nephrin，podocin和α-actinin-4表达，其蛋白大小分别为180KDa，45KDa和100KDa。结论：首次在mRNA水平及蛋白水平证实了小鼠MPC5能够表达nephrin，podocin及α-actinin，为进一步研究这些分子间的相互作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫水通道蛋白9的多肽特征及免疫定位研究

目的 研制细粒棘球绦虫水通道蛋白9 (EgAQP9)的特异性多肽抗体,并用于检测其在棘球蚴囊壁、生发细胞及原头蚴中的组织分布情况。 方法 根据EgAQP9特异氨基酸序列设计合成B细胞抗原多肽,再用合成的多肽偶联KLH作为免疫原注射免疫新西兰兔以制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测多肽抗体滴度,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定多肽抗体免疫活性,免疫荧光实验分析EgAQP9的亚细胞定位,免疫组化实验分析EgAQP9组织定位。 结果 免疫新西兰兔成功制备出多肽抗体;间接ELISA检测其多肽抗体效价高达1∶256 000;Western blot结果显示多肽抗体能够特异识别细粒棘球绦虫中36 kDa处的条带,与EgAQP9预测的相对分子量大小相符;免疫荧光实验结果显示EgAQP9分布于棘球蚴生发细胞的胞质、胞膜中;免疫组化实验显示该蛋白主要分布在原头蚴表面及棘球蚴囊泡生发层。结论 本研究以制备的EgAQP9兔源多克隆抗体定位了AQP9在棘球蚴生发细胞、原头蚴及棘球蚴囊壁中的分布状况。     

抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的 采用扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)的合成多肽为免疫原制备鼠源单克隆抗体,并用4种埃博拉流行株核蛋白基因的真核表达蛋白对制备的单克隆抗体进行特异性分析。方法 用人工合成的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白多肽免疫动物,进行细胞融合后筛选阳性杂交瘤细胞。构建埃博拉病毒4种亚型的真核表达载体转染HEK293T细胞以表达目的蛋白,再以真核表达蛋白为抗原,用免疫印迹方法分析扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的特异性。结果 完成了抗扎伊尔型单克隆抗体的制备,共得到能分泌抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞12株,小鼠腹水抗体效价介于1∶10⁴~1∶10⁵,其中3株杂交瘤细胞株分泌的抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体与其他3种亚型无交叉反应,抗体效价高、特异性好。结论 成功制备抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体,为建立快速检测埃博拉病毒的方法奠定基础。     

抗人胃癌相关蛋白GCRG213多克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的 制备胃癌相关蛋白GCRC213的多克隆抗体. 方法在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗GCRG213的抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和止常组织中的表达. 结果在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为29 400的thioredoxin/GCRG213融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备兔抗GCRG213抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1:256 000.Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG213蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织. 结论兔抗GCRG213抗体的成功制备,为进一步研究GCRG213的牛物学功能及其在胃癌发牛发展中的作用奠定了基础.     

人血清反应因子基因的原核表达及鸡卵黄多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达人血清反应因子(serum response factor,SRF)基因,制备鸡卵黄抗SRF抗体并鉴定其特性.方法 构建SRF表达载体PGEX-T-2-SRF,并在大肠杆菌中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经谷胱甘肽-S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行鉴定.用纯化的SRF免疫海蓝白母鸡,制备鸡抗SRF抗体.抗体的效价及特异性用蛋白质印迹技术进行测定和分析,免疫荧光鉴定其在心肌细胞中的定位.结果 构建的重组质粒PGEX-4T-2-SRF在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清液中,纯化的SRF经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的SRF免疫制备了鸡抗SRF抗体.蛋白质印迹技术结果表明,该抗体可与原核表达的SRF特异性结合,抗体效价为1:5000.免疫荧光证实该抗体可以和心肌细胞的细胞核特异性结合.结论 在原核细胞中表达了SRF制备的鸡抗SRF的抗体对SRF能进行特异性结合.     

泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备

目的探讨制备泡沫细胞相关基因4多克隆抗体的方法。方法将从人胎肝文库经聚合酶链反应扩增获得的泡沫细胞相关基因4基因全长cDNA序列，通过生物信息学分析，预测泡沫细胞相关基因4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域．并进行了多序列比对，并根据蛋白质的亲疏水性、二级结构、偶联难度及实验难度等，确定泡沫细胞相关基因4抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，采用固相多肽合成法合成该抗原片段．偶联后经过基础免疫，6次加强免疫，经追踪检测，于第四次免疫后10～14天颈动脉放血，分离血清，冷冻抽干，-20℃保存而制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体。结果用固相多肽合成法成功制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体，该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1：16000，Western blot检测可见40kDa处有目的带，用免疫组织化学方法从HepG2细胞中检测到泡沫细胞相关基因4蛋白表达，证实该抗体具有较好的反应性和特异性。结论固相多肽合成法省时、省力、制备的抗体效价高；泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备，为进一步研究泡沫细胞相关基因4蛋白在动脉粥样硬化中的功能作用奠定了基础。     

寨卡病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及性能评价

目的制备抗寨卡病毒衣壳(Capsid,C)蛋白的单克隆抗体,并对该抗体的性质进行初步分析。方法设计并合成寨卡病毒C蛋白多肽,将多肽与BSA偶联后免疫小鼠,采用细胞融合技术融合、筛选杂交瘤细胞株,制备抗寨卡病毒C蛋白的单克隆抗体,并应用ELISA、Western blot及免疫荧光等方法对抗体的反应效价、亚型和特异性进行分析。结果筛选获得1株与C蛋白具有良好结合活性的小鼠单克隆抗体9C1,属于IgM亚型,其重链约为50ku,轻链约为25ku,该抗体能够与寨卡病毒感染细胞后表达的C蛋白反应。结论筛选获得了抗寨卡病毒C蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好反应性和特异性,为开展C蛋白的功能和寨卡病毒病的相关防治方法奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌DdlA多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定参与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)细胞壁中肽聚糖合成与成熟的D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(D-Alanyl-D-Alanine ligase, DdlA)多克隆抗体,并检测其效价。方法在NCBT数据中检索获取Rv2981c基因(ddlA)序列信息并构建其表达载体pColdⅡ-Tb-ddlA,在大肠埃希菌表达体系中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导DdlA蛋白表达,以琼脂糖树脂(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫BALB/c雌鼠,制备抗DdlA多克隆抗体。通过ELISA检测其效价,Western blot分析抗体特异性。结果成功获得可溶性表达分子质量约为40 ku的DdlA蛋白,免疫小鼠后制备的抗DdlA多克隆抗体ELISA效价为1∶2 000;Western blot检测该抗体能识别分枝杆菌内源性的DdlA蛋白。结论成功制备了抗DdlA蛋白多克隆抗体。该抗体具有特异性且效价高,为研究其在结核分枝杆菌致病中的作用和筛选靶向DdlA抑制剂奠定了基础。     

HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果

目的:探讨针对HBV preS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系,作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBVDNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性最强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.     

猪FMDV受体整联蛋白β1亚基LBD多克隆抗体的制备和初步应用

目的表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β1亚基配体结合域β1LBD,制备兔抗β1LBD多克隆抗体检测β1p-CHOK1细胞β1亚基的表达。方法利用PCR方法扩增整联蛋白β1LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后与pGEX-4T-1原核表达载体相连,构建的pGEX-β1LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA和Western blot方法分别鉴定抗体的效价和特异性,并用制备的抗体以间接免疫荧光抗体法对β1p-CHOK1细胞中β1亚基的表达进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析显示阳性菌经诱导后表达一Mr约为42000的GST-β1LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β1LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性,间接免疫荧光显示β1p-CHOK1细胞β1亚基表达于其细胞表面。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗猪源整联蛋白β1LBD多克隆抗体,为深入研究猪源整联蛋白β1在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。     

扩张型心肌病新型抗钙通道抗体的发现

目的:观察扩张型心肌病(DCM)患者血清中是否独立存在抗心肌细胞L型钙离子通道(Human Cav1.2)自身抗体(简称:抗钙通道抗体)。方法:以合成多肽片段作为抗原,用ELISA法检测DCM患者(DCM组)及正常人(正常对照组)(各60例)血清中的抗钙通道抗体和抗心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白(ANT)抗体。用亲合层析法提纯DCM患者(DCM组)血清中的抗钙通道抗体,以制备的大鼠抗Human Cav1.2α1亚单位多克隆抗体作为阳性对照,用免疫印记技术,免疫荧光组织化学技术检测DCM患者血清中抗钙通道抗体。结果:ELISA检测60例DCM患者中29例抗钙通道抗体阳性(29/60,阳性率48.33%),明显高于正常对照组(4/60,6.67%,P<0.01)。抗钙通道抗体和抗ANT抗体检出结果无一致性(P>0.05)。免疫印记中亲合层析法提纯的DCM患者抗钙通道抗体可特异地识别240000的多肽(Human Cav1.2α1c亚单位),结果与阳性对照相符。抗钙通道抗体经抗原充分吸附后特异性识别被阻断。免疫荧光实验显示,抗钙通道抗体能特异性地结合在大鼠心室肌细胞膜上。结论:DCM患者血清中存在新型的抗钙通道抗体。     

生长相关蛋白43通过抑制T细胞核因子1入核保护足细胞的机制

目的:探讨生长相关蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)通过抑制T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)入核,从而保护足细胞的机制。方法:(1)通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜,观察GAP-43在不同肾小球疾病患者足细胞中的表达情况。(2)体外培养小鼠永生化足细胞,用脂多糖(LPS)100μg/ml分别刺激足细胞0h、24h、48h、72h后,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹检测GAP-43 mRNA和蛋白的表达。(3)通过Western印迹检测足细胞过表达GAP-43后对足细胞标志蛋白nephrin、钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)及核内NFATc1蛋白表达的影响。(4)通过划痕实验观察足细胞的活动性。结果:(1)与正常肾组织相比,肾小球疾病患者肾组织足细胞GAP-43表达降低;(2)用LPS刺激足细胞,72h后GAP-43的表达降低最明显;(3)足细胞过表达GAP-43蛋白并用LPS刺激后,升高的CaN表达下降,NFATc1入核降低(P0.05),降低的足细胞标志蛋白nephrin表达显著恢复(P0.05)。(4)过表达GAP-43蛋白并用LPS刺激后,足细胞的活动性降低。结论:GAP-43在足细胞中表达,是足细胞的一个保护因子,可能通过参与CaN-NFAT信号通路,抑制NFATc1的入核来保护足细胞损伤。     

膜性肾病肾活检组织中nephrin和podocin表达改变及其意义

目的:检测膜性肾病(MN)患者肾活检组织中nephrin、podocin的表达和分布,分析MN蛋白尿与nephrin和podocin表达改变的关系,探讨肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin在MN蛋白尿发生中的作用. 方法:选取2005年1月至2008年1月经肾穿刺活检病理确诊为II、III期MN的患者22例,其中肾病综合征组15例(MN-A组),非肾病综合征组7例(MN-B组),临床上排除系统性红斑狼疮、乙肝相关性肾病、糖尿病肾病以及肿瘤等继发性肾脏疾病;另取5例因肾脏肿瘤行一侧肾切除的远端相对正常肾脏组织作为对照(对照组).收集并分析患者的主要临床表现、内生肌酐清除率(Ccr)、尿常规、24h尿蛋白定量、血清白蛋白(Alb)、血脂等相关临床资料;按常规方法取肾组织制备3 μm厚石蜡切片,行HE、PAS、PASM、Masson染色普通光镜以及免疫组化(IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q)检查;各组肾组织行nephrin、podocin及IV型胶原α3链免疫荧光双套色染色,激光共聚焦显微镜下观察nephrin、podocin在两组MN及对照组肾组织中表达及分布的改变,以计算机图像分析系统进行半定量分析. 结果:22例MN病理分期分别为II期14例,III期8例;肾小球内免疫球蛋白及补体的沉积以IgG和C3为主,呈颗粒状沿毛细血管袢弥漫性分布.对照组肾组织免疫荧光染色可见nephrin和podocin沿肾小球毛细血管袢呈均匀连续线样分布;MN患者肾小球内nephrin与podocin表达皆明显减弱,免疫荧光强度降低,分布不均,部分区域有节段性缺失,部分由线状分布变成颗粒状分布,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);MN-A组与MN-B组比较,MN-A组肾小球nephrin和podocin的平均表达量均低于MN-B组,差异有统计学意义(P<0.05),且尿蛋白量与nephrin或podocin表达呈负相关. 结论:MN患者肾小球内nephrin和podocin表达量均降低,分布形式亦发生改变,部分呈节段性缺失或不连续颗粒状分布,并与尿蛋白排泄量呈负相关,提示nephrin和podocin表达的减少及分布异常可能与蛋白尿发生及蛋白尿程度有关;但其损伤的始动因素仍需进一步探讨.     

伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子在红内期的表达

目的制备小鼠抗伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子(PbMIF)的抗体,并检测PbMIF在伯氏疟原虫红内期的表达。方法用纯化的PbMIF蛋白免疫BABL/c小鼠,制备小鼠抗PbMIF的抗血清。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的效价,用免疫印迹(Western blotting)-二氨基联苯胺(DAB)底物显色法检测抗体的特异性。采用免疫印迹增强化学发光(ECL)的方法,用上述制备的抗血清检测PbMIF在红内期伯氏疟原虫的表达情况。结果ELISA测得小鼠抗PbMIF抗体的效价>1∶106,Western blotting显示该抗体可与原核表达的PbMIF蛋白特异性结合。ECL结果表明感染的红细胞中存在PbMIF。结论成功制备了小鼠抗PbMIF的抗体。红内期伯氏疟原虫表达PbMIF。