人细小病毒B19中国株VP1蛋白独特区基因片段序列变异分析

目的 研究B19病毒中国株独特区VP1的基因变异。方法 采用聚合酶链反应技术（PCR）从两侧中国再生障碍性贫血患儿血清中扩增VP1独特区基因片段，将其与PUC19连接，酶切鉴定筛选阳性克隆后测序分析。结果 从一个患儿的血清中扩增出约480bp目的片段，并成功构建PUC19－VP1质粒，测序结果显示，与国外已发表的Wi株VP1独特区序列相比，有2处核苷酸发生改变，并可致所编码的氨基酸变化。结论 中国B19病毒VP1独特区有变异。     

河南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的了解河南省2010年柯萨奇病毒A组16型(CA16)流行株VP1区基因特征。方法对河南省2010年手足口病(HFMD)粪便和咽拭子样品中分离到的10株CA16病毒,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP1编码区基因扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列分析,与已报道的CA16标准株序列构建基因亲缘关系树。结果 10株CA16毒株,其VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~100.0%,99.3%~100.0%,与国际CA16标准株G10在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为67.0%~69.0%,72.0%~74.0%。亲缘进化树显示全部CA16株可分为A和B两个基因型,B基因型又可分为B1和B2两个基因亚型。河南省分离的CA16毒株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a和B1b两条进化分支在河南省共同流行。结论河南省手足口病感染CA16病毒的流行株属B1基因亚型,有B1a和B1b两个进化分支共同进化和循环。     

天津市2018—2020年人轮状病毒株VP7、VP4和NSP4基因特征

目的 对天津流行的人A组轮状病毒VP7、VP4和NSP4基因进行分型和序列特征分析。方法 收集2018—2020年天津市急性腹泻A组轮状病毒（Rotavirus group A, RVA）阳性病例的粪便标本,提取核酸,进行RT-PCR扩增VP7、VP4和NSP4基因片段全长并进行测序和进化树分析。结果 本次研究所有RVA均属于G9P[8]基因型,进化树分析其VP7和VP4基因分别属于G9-VI和P[8]-3亚型。分析NSP4基因片段发现19株为E1型,12株为E2型。TJ株VP7、VP4、NSP4与疫苗株和参考株比对发现在关键位点有氨基酸替代现象。31个TJ-VP7氨基酸序列与 Rotavac G9 和Rotasiil G9 VP7相比,各有4个和3个替换位点。31例天津株VP8*核苷酸序列与Rotarix P[8]-1和RotaTeq相比,各有6个和3个氨基酸差异。天津株VP5*核苷酸与两种疫苗相比,仅在RotaTeq的5-1区I388L这一处发现氨基酸位点变异情况,其余11个氨基酸位点高度保守;而与Rotarix5-1到5-5区氨基酸序列完全一致。TJ E1株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI和ASII区分别有2和3个氨基酸位点发生变异;TJ E2株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI-ASIV分别有3、8、2和5个氨基酸位点发生替换。2018—2020年在天津地区检测到19株G9P[8]-E1型RVA,12株G9P[8]-E2型RVA,这是首次在天津发现G9P[8]-E2重组基因型。结论 与同基因型疫苗株和参考株相比,位于TJ株VP7、VP4和NSP4抗原位点的改变对于疫苗保护效力的影响还需进一步研究。需要对轮状病毒分子变异和重组现象进行持续监测,不只是单一监测G/P分型情况,要考虑多基因片段共同分析和全基因组测序,以便及时追踪和掌握轮状病毒的重组和变异情况。     

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白（VP1）基因测序分析

目的 对来自广东地区感染小鼠诺如病毒（Murine Norovirus,MNV）的小鼠进行病毒分离鉴定,对病毒的衣壳蛋白（VP1）基因进行测序和序列分析,绘制系统发生树,了解广东地区MNV的分子遗传特征和进化来源。方法 采用RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T 载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15 株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果 从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7~100%和94.8~100%之间, 15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5~92.9%和92.4~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B 的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、 Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论 成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析

目的分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16)VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异。方法对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树。结果河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3%~98.1%、氨基酸同源性为100.0%,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7%~82.6%,氨基酸同源性为100.0%;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3%~95.7%、92.8%~98.6%、88.9%~91.8%,氨基酸同源性均为100.0%。河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致。结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据。     

柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究

目的　通过检测分析2015年杭州市柯萨奇病毒A组16型（CA16）病毒株VP1区核苷酸序列,掌握杭州市CA16的流行情况及种系进化关系,为手足口病的预防和治疗提供支持,同时为CA16疫苗株的选择提供依据。方法　收集2015年杭州市儿童医院256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子,利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增CA16病毒株VP1区核苷酸序列（约1 020 bp）,测序后利用DNASTAR和Primer Premier 5.0进行序列比对分析,并用Mega 3.1软件建立检测样本VP1区序列与GenBank上CA16参考毒株VP1核苷酸序列的系统发育树。结果　共分离到80株CA16阳性病毒。序列比对分析结果显示,CA16分离株的核苷酸同源性为90.8%～100.0%,氨基酸同源性为99.5%～100.0%。系统发育树分析结果显示,17株CA16全部属于B1基因亚型,并且同时存在B1a和B1b两个进化分支,其中4株属于B1a亚型,13株属于B1b亚型。结论　2015年杭州市CA16病毒株属于B1基因亚型,与国内外某些地区手足口病病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。     

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒(coxsackie virus B3,CVB3)分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离,肠道病毒组合血清进行鉴别,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒目的片段,测序后进行VP1基因分析,用Mega4.1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中,分离到CVB3,其VP1区的核苷酸长度为849bp,未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433/SD/CHN/2004/CB3株、山东05280/SD/CHN/2005/CB3株及山东YZ127/SD/CHN/2005/CB3株氨基酸同源,与其余国内分离株同源性高于为99.29%,与国外毒株的同源性为95.41%~96.47%。在进化树上与AM06HZ/SD/CHN/2006/CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),分离株(KMA103-09)VP1区变异较小。     

银川市2016—2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 分析银川市2016—2022年引起手足口病的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)VP1的基因特征,为手足口病的防治工作提供有效的参考依据。方法 收集2016—2022年银川市手足口病所有CV-A6核酸呈阳性的标本进行病毒分离培养,应用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP1区完整基因核酸片段进行核苷酸序列测定,利用测序结果进行系统发育树构建、同源性分析及氨基酸突变位点分析。结果 2016—2022年银川市共分离到手足口病CV-A6型毒株90株,测序后成功获得CV-A6 VP1区全长序列的毒株83株。完整VP1区基因均由915个核苷酸组成,编码305个氨基酸。系统发育分析显示,2016—2022年银川市83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支;同源性分析表明,银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)之间核苷酸相似性为82.1%～84.1%,氨基酸相似性为76.2%～80.5%,遗传距离较远;银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株的VP1区氨基酸序列比较发现32个氨基酸位点出现变异。结论 2016—2022年银川市...     

一株柯萨奇病毒B组5 型(Cox.B5) 病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。     

B19 VP2抗原真核表达载体的构建及免疫原性观察

目的：探讨以B19 VP2基因为靶基因构建的真核表达载体作为基因疫苗的免疫原性。方法：用PCR方法以pGEM1-B19为模板扩增出B19 VP2目的基因;将其重组入真核表达载体pcDNA3;将重组子pcDNA3-VP2及空质粒分别用脂质体包裹接种家兔;ELISA方法检测家兔血清中B19 VP2抗体产生情况。结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3-VP2;其作为基因疫苗接种家兔后可产生滴度较高,持续时间较长的抗体。结论：B19 VP2基因可作为B19病毒基因疫苗构建的靶基因。     

人微小病毒B19 VP2蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：利用原核系统表达人微小病毒B19的重组蛋白抗原,为建立ELISA方法诊断B19病毒感染提供特异性抗原。方法：采用PCR方法扩增B19 VP2基因,将之插入到T载体中进行测序,验证序列正确后再重组入原核表达载体pET-30a( ),并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达。用SDS-PAGE分析表达产物。表达产物经亲合层析柱纯化得到VP2重组蛋白抗原。用B19 VP2 IgG对该蛋白进行了Western-Blot分析。结果：筛选出2株B19 VP2蛋白抗原高表达菌株,经IPTG诱导后,表达VP2重组蛋白量占菌体总蛋白量的24．6％。结论：VP2重组蛋白具有良好的抗原活性。     

新型肠道病毒89型结构蛋白VP1的构建表达及序列分析

目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白．并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH—VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性。将EV89VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树。结果重组质粒在1mmol／L的IPTG37℃诱导7h后可诱导表达得到约33kD的蛋白。经WesternBlot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性。分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与Genbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86．4％、85．9％、85．6％。结论成功构建EV89重组蛋白．其表达产物具有良好的特异性及活性,可进-步用于VP1检测方法的研制。进化分析表明,分离的EV89VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远。     

人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的:通过DNA 重组技术,构建B19 病毒XA株VP1全长基因表达载体, 诱导重组VP1融合蛋白表达. 方法:自B19病毒感染患者血清中提取病毒DNA为模板,用PCR法扩增编码VP1蛋白的全长基因片段,以pET28(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET28(a)-VP1,转化E. coli. BL21(DE3),获得重组工程菌株.经IPTG诱导培养获得高效表达的VP1融合蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物;并以该重组融合蛋白为抗原,免疫家兔,ELISA法检测所获抗体效价. 结果:①获得了含重组表达质粒pET28(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白.②经ELISA法检测抗VP1多克隆抗体效价为1: 12 800. 结论:重组工程菌可表达VP1融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性,对诊断试剂制备及疫苗研制具有重要意义.     

江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的:了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型(CA16)分离株VP1区基因特征?方法:选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树?结果:14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%?江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支?结论:江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别?B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系?